用于鉴定致倦库蚊的dna条形码标准基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别设及一种用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基 因及应用。
【背景技术】
[0002] 目前，国内外对媒介生物的分类鉴定主要依靠传统的形态学分类手段。该方法主 要针对成虫阶段，对卫生监管实际工作中捕获的其他发育阶段(幼虫、蛹等）的媒介生物则 受到限制；对外部形态相似的近缘种媒介生物的鉴定，形态学分类方法的准确度偏低；另 夕h实际工作中经常会采集到不完整的样品，形态学方法对残缺样品的鉴定遇到很多困难。 在口岸检疫工作中，如果截获的是幼虫、卵、蛹等非成虫虫态，通常需要将其培养成成虫后 再进行鉴定，整个检疫鉴定过程时间长达数周，也经常会采集到不完整的样品，形态学方法 对残缺样品的鉴定遇到很多困难，大大地加长了通关周期，影响贸易往来。
[0003] 近代分子生物学技术的兴起，为古老的昆虫学科注入了新的活力。在昆虫学研究 领域，分子生物学技术主要应用于系统演化及分类鉴定两方面。昆虫系统演化的研究是从 分子水平上找出其种间的DNA序列的特异性差异，主要目的为探索昆虫种、属间的相对亲缘 关系，同时也为昆虫的分子鉴定奠定了基础。
[0004] DNA分类是W生物的DNA序列的差异为依据，来区分生物物种并构建全新的分类学 系统(Tautz et al.，2002)。在生物分类中，WDNA序列作为生物物种识别的方法最初应用 于病毒、细菌和原生动物类群的研究中，后来运种方法广泛应用于物种多样性的调查研究 中，并积累了大量的数据和文献。2003年，DNA条形码概念首次提出：鉴定物种就如同使用商 品UPC条形码，使用扫描仪就能识别。它的原理是利用基因组DNA上一段标准的或者大家公 认的基因片段，作为分子祀标来进行种级水平的种类鉴定。DNA条形码序列与整个基因组 DNA相比要短得多，而且非常容易获得。因为COI基因的通用引物可W很容易获得绝大多数 动物的5'端序列，加拿大圭尔夫大学的学者化bed等提出利用COI的特定区段来做DNA条 形编码的基础，用于物种识别化ebert et al., 2003; Remigio & He;rbe;rt, 2003)。理论 上，DNA序列上的每个位点都有4、1\6、(：四种可能，45个碱基的序列就可^区分开近10亿个 物种，运远远超过现存物种的总数，即使由于自然选择的原因，某些位点已经被固定，导致 组合数减少一些，但是现代分子技术可W很容易的扩增出几百个碱基的序列，足够区分所 有的物种（肖金花等，2004)。而且DNA序列属于数字信息，方便管理又具有可重复性，易于 交流和联合分析(Hebert et al.，2003)。
[0005] DNA条形码技术为物种的鉴定提供了新的手段，弥补了传统分类的诸多不足。尤其 适用于难W用形态分类特征进行鉴定的幼虫、卵等虫态。利用分子标记进行种类鉴定国际 上已有不少的尝试，国际上第一篇利用DNA条形码进行物种鉴定的是2003年化bed，随后 Ball等(2005)尝试用分子条形码鉴别了 70多种水生蜂聰，游中华等(2007)用线粒体COI鉴 别了入侵害虫西花劑马及其他8种常见劑马。肖金花等中国卫生检验杂志2011年3月第21卷 第3期畑inese Journal of Health Laboratory Technology,Mar 2011; Vol 21 No 3 615( 2004)综述了线粒体COI片段在物种鉴定方面的独特优点，并指出DNA条形码技术为生 物分类学的新动向。
[0006] 但由于目前DNA条形码数据库中种类不全，缺乏多个物种的标准DNA条形码参考序 列，致使DNA条形码鉴定技术达不到实际应用的目的。
[0007] 致倦库蚊为疾病的重要传播媒介，不仅对间日追原虫易感，而对恶性追原虫也有 较高的易感性，是我国班氏丝虫病的主要传播媒介，曾从致倦库蚊中分离到登革病毒。在检 验检疫工作中，经常会截获的是幼虫、卵、蛹等非成虫虫态，或者肢体残缺的样品通常需要 将其培养成成虫后再进行鉴定，整个检疫鉴定过程时间长达数周，也经常会采集到不完整 的样品，形态学方法对残缺样品的鉴定遇到很多困难。
【发明内容】
[0008] 本发明的首要目的是克服上述不足问题，提供一种用于鉴定致倦库蚊的DNA条形 码标准基因。
[0009] 本发明的另一目在于提供一种用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因的应用方 法。
[0010] 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：用于鉴定致倦库蚊的D N A条形码 标准基因，其特征在于:所述用于鉴定致倦库蚊的D N A条形码标准基因的核巧酸序列如 TC Slf-=^^.
[0011] -种所述用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因的应用，其特征在于:将所述的 用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因应用于鉴定待检标本中。
[0012] 进一步地，所述待检标本为非成虫虫态，残缺不全的虫体或成虫。
[0013] -种利用所述用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因鉴定致倦库蚊的分子生物 学鉴定方法，其特征在于:包括如下步骤： (1) 提取待检t不本的基因组DNA: (2) 使用如下的引物进行PCR扩增，得至化CR产物； 上游引物ACEquin: 5 ' - CCTTCTTGAATGGCTGTGGCA-3 ' ； 下游引物812463:5'-了6646(：押0：1'(：7^4〔66-3'； (3) 将PCR产物进行电泳分析，如果能扩增出目的条带，则提取该目的条带中的产区进 行测序，如果扩增出的产物没有目的条带，则能排除该待检标本为致倦库蚊的可能性； (4) 测序得到的结果与所述的用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因的同源性在98% W上时，则能判断待检标本为致倦库蚊。
[0014] 进一步地，步骤(1)中所述的待检标本为非成虫虫态、残缺不全的虫体或成虫。
[001引进一步地，步骤(2)中所述的PCR的条件为：94°C预变性5min;94°C 30s，52°C 30s， 72°C 1111111，35个循环；72°(：延伸5111111; 步骤（2)种所述的PCR的体系为：20化PCR体系：10 X buffer (含Mg2+), 2.0化dNTPs (2.5 mmol/L)，上下游引物各化L，0.25化DNA聚合酶，I化模板DNA，纯水补充体积至20化； 步骤(2)中所述的PCR在进行时设置阴性对照和阳性对照： 所述的阳性对照为权利要求1所述的用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因或含有 权利要求1所述的用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因的序列； 步骤(3)中所述的目的条带为在分子标记(DNA Marke;r)240bp条带位置的电泳带，或是 与阳性对照同一位置的电泳带。
[0016] 本发明适应国境口岸卫生检疫工作的实际需要，利用DNA条形码技术，针对致倦库 蚊，建立一种相对稳定和准确的分子鉴定方法。可W对残缺样品进行鉴定，对致倦库蚊与其 近缘种能够很好的区分鉴定，对致倦库蚊非成虫阶段的能够进行准确的鉴定。对提高致倦 库蚊分类鉴定的准确性、促进卫生监管工作的质量提升具有重要的促进作用。
【附图说明】
[0017] 图1为致倦库蚊的分子生物学特异性鉴定的PCR产物电泳结果图，图中1-5为致倦 库蚊基因组DNA，M为DL2000 marker。
[0018] 图2为用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因灵敏度实验电泳图，图中由左到 右，每一格为一个浓度，依次是1〇-1，1〇-2，1〇-3，1〇-4，1〇-5。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施 例。 实施例
[0020] -种用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因，该基因核巧酸序列（239bp)如下所 示：
[0021] 所述用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因的制备方法： (1)野外采集致倦库蚊成虫或幼虫，实验室条件饲养至性状稳定。
[0022] (2)采用宝生物DNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST 加 iversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒（Code No. 9765))提取致倦库蚊DM。
[0023] (3)DNA标准样品的制备:将测定浓度后的DNA按化g/管进行分装，每种核酸分子标 样分装100管，然后冻干，待用。
[0024] (4)取制备的DNA标准样品，加入50yL的化is EDTA(TE),溶解后作为模板使用，经 采用特异性进行PCR并测序，进行定性分析，与近缘种中华按蚊进行比较，确认所制备的DNA 标准样品为所述DNA条形码标准基因样品。
[0025] 对所述用于鉴定致倦库蚊的DNA条形码标准基因进行DNA完整性、均匀性、稳定性 测试： 1. DM标准基因质量及完整性检测 取制备的DNA，进行凝胶电泳、纯度及浓度检测。
[0026] (1 )DNA完整性检测:直接法-用提取的DNA直接电泳检查，120V，1.5%琼脂糖凝胶电 泳，观察条带的完整性，检测结果条带完整，无弥散状，说明DNA条带完整性较好； (2)DNA浓度及纯度检测：紫外分光光度计法-吸取化L DNA用分光光度计测定26化m和 280nm的吸收值，然后根据0〇26日/0化8日值判断DNA纯度，并根据0D26日计算其浓度。按W下公式 计算：
2. DNA标准基因均匀性分析 为检查制备的目的核酸标准样品的均匀性，采用PicoGreen DNA分子巧光定量方法及 紫外分光光度法，取随机抽取15管样品，每管样品分成2份子样进行测试，结果见表1数据，F 检验见表2,结论:在95%置信概率下，与其他因素对测试结果的影响相比，样品的不均匀性 是可接受的。
[0027] 表1致倦库蚊鉴定用DNA标准基因均匀性检测结果
3.DM标准基因稳定性分析 本标准基因采用的是加速稳定性实验，溫度分为3个档，分别为-