Pilra基因作为诊断骨质疏松症的分子标志物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子诊断领域，设及一种用于骨质疏松症诊断的分子标志物，具体设 及血液中的分子标志物-PILRA基因在制备诊断骨质疏松症的产品中的应用。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松即骨质疏松症，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的巧化，巧盐 与基质呈正常比例，W单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松 中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。W骨骼疼痛、易于骨折为特征。
[0003] 流行病学资料显示，美国约8百万人患骨质疏松症，2千万人骨量减少，每年有150 万患者由于骨质疏松引发骨折。绝经后白人妇女骨质疏松发病率为17%，黑人妇女发病率 为6 %。年龄大于50岁人群中，将近50 %女性和25 %男性存在骨质疏松性骨折的潜在风险。 我国是老年人口绝对数数量最多的国家，《骨质疏松症防治中国白皮书》根据2006年全国性 汉族人群抽样调查结果显示，估算全国50岁W上人群中，约有6944万人（男1534万，女5410 万）患有骨质疏松症，有2.1亿人患低骨量，存在骨质疏松症风险，预计到2020年我国骨质疏 松和低骨量患者将增加至2.8亿。
[0004] 目前诊断骨质疏松症主要依赖骨密度影像学检测方法，骨密度测定方法包括W下 几种:X线光密度法、单光子吸收法、双光子吸收法、双能X线吸收法、定量计算机体层摄影、 中子活化分析法、超声定量测量、磁共振测量、定量磁共振成像、高分辨率磁共振成像。上述 方法主要的局限在于不能在骨质疏松症发生的早期给出可靠的判断。
[0005] 为了提高骨质疏松症的治疗有效率，降低患者和国家的经济负担，寻找一种用于 骨质疏松症早期诊断的方法是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨质疏松症 (Os t er art虹i t i S，OA)早期诊断的分子标志物。相比传统的骨质疏松症的诊断方法，使用基 因标志物来诊断骨质疏松症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能 知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[000引本发明提供了检测PILRA基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的工具中的应 用。
[0009] 进一步，上面所提到的检测产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位 杂交、忍片或高通量测序平台检测PILRA基因的表达水平W诊断骨质疏松症的产品。
[0010] 进一步，所述用RT-PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增PILRA基因 的引物;所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增PILRA基因的引 物;所述用免疫检测诊断骨质疏松症的产品包括:与PILRA蛋白特异性结合的抗体;所述用 原位杂交诊断骨质疏松症的产品包括:与PILRA基因的核酸序列杂交的探针;所述用忍片诊 断骨质疏松症的产品包括:蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括与PILRA蛋白特异性 结合的抗体，基因忍片包括与PILRA基因的核酸序列杂交的探针。
[0011] 在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包 括一对特异扩增PILRA基因的引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0012] 优选地，所述诊断工具包括忍片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测 序平台是一种特殊的诊断工具，检测PILRA基因表达的产品可W应用于该平台实现对PILRA 基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成 为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的 异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知PILRA基因的异常与骨质疏松症相关也属于 PILRA基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0013] 本发明还提供了一种诊断骨质疏松症的工具，所述产品包括忍片、试剂盒、试纸、 或高通量测序平台。
[0014] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白质忍片;所述基因忍片包括固相载体W及固定 在固相载体的寡核巧酸探针，所述寡核巧酸探针包括用于检测PILRA基因转录水平的针对 PILRA基因的寡核巧酸探针;所述蛋白质忍片包括固相载体W及固定在固相载体的PILRA蛋 白的特异性抗体;所述基因忍片可用于检测包括PILRA基因在内的多个基因（例如，与骨质 疏松症相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质忍片可用于检测包括PILRA蛋白在内的多 个蛋白质(例如与骨质疏松症相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与骨质疏松症的 标志物同时检测，可大大提高骨质疏松症诊断的准确率。
[001引其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试 剂盒包括用于检测PILRA基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括PILRA蛋白的 特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或忍片 方法检测PILRA基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对PILRA基因的 引物和/或探针。根据PILRA基因的核巧酸序列信息容易设计出可W用于检测PILRA基因表 达水平的引物和探针。
[0016] 所述高通量测序平台包括检测PILRA基因表达水平的试剂。
[0017] 所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核巧酸，所述寡核巧酸能够检测 PILRA基因的转录水平。
[0018] 与PILRA基因的核酸序列杂交的探针可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它 衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核巧酸序列特异性结合， 任何长度都可W。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的 长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂 交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超 过30个碱基对，与目的核巧酸序列互补的长度W15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序 列最好少于4个碱基对，W免影响杂交效率。
[0019] 进一步，所述PILRA蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PILRA蛋 白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、 化b、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与PILRA蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平 的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可W使用任何方法来制备所述抗体。
[0020] 在本发明的具体实施方案中，所述针对PILRA基因的引物序列如下:正向引物序列 如SEQ ID NO. 3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。
[0021] 用于诊断骨质疏松症的PILRA基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织 液、尿液、唾液、脊髓液等可W获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊 断骨质疏松症的PILRA基因及其表达产物的来源是血液。
[0022] 在本发明的上下文中，"PILRA基卸'包括PILRA基因W及PILRA基因的任何功能等 同物的多核巧酸。PILRA基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PILRA基因 (NC_000007.14)DNA序列具有70%W上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0023] 优选地，PILRA基因的编码序列包括W下任一一种DNA分子：
[0024] (1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA序列；
[0025] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0026] (3)与（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、优选地，90% W上同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA分子。
[0027] 在本发明的具体实施方案中，所述PILRA基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[00%]在本发明的上下文中，PILRA基因表达产物包括PILRA蛋白W及PILRA蛋白的部分 肤。所述PILRA蛋白的部分肤含有与骨质疏松症相关的功能域。
[0029] "PILRA蛋白"包括PILRA蛋白W及PILRA蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括PILRA蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或