逆转录病毒载体的制作方法

逆转录病毒载体的制作方法
【专利说明】逆转录病毒载体 发明领域
[0001]本发明设及一逆转录病毒载体，其中顺式作用元件位于3'LTR的下游。运些元件因 此存在于所述病毒的RNA基因组中，运样可W被包装进病毒颗粒，但在所述被逆转录的基因 组区域外，因此不在所述祀细胞的所述载体DNA中。运减少了转移载体顺式作用元件在祀细 胞内持久性存在的弊端。
[醒]发明背景
[0003] 逆转录病毒载体是最早开发的用于哺乳动物基因转移的病毒载体之一。几种逆转 录病毒已被开发成为载体，特别地有alpha逆转录病毒（1) ,gamma逆转录病毒(2)，慢病毒I 型人免疫缺陷病毒化IV-I) (3)，非人类慢病毒(4)，W及泡沫病毒(5)。
[0004] 在从逆转录病毒改进为逆转录病毒载体中最重要的结构改变为将发生基因转移 的核酸上的需要W顺式起作用的病毒的非编码序列与产生病毒颗粒的生产细胞中需要W 反式起作用的病毒蛋白编码序列分离。由于在祀细胞内不产生病毒蛋白，运种分离使得所 述载体只能感染一轮。
[0005] -种标准的第S代基于HIV-I的慢病毒载体，如服L或CCL(3)要求四种质粒共转进 入生产细胞才能产生病毒颗粒（图1): 一含有必要的顺式作用元件和转基因表达框的转移 载体、一表达HIV-I多聚蛋白Gag和Gag-化1的包装质粒、一表达HI V-IRev蛋白的质粒和一表 达所述病毒包膜蛋白的质粒。如果在生产细胞中共表达其他包膜病毒的包膜蛋白，慢病毒 载体也能够将该包膜蛋白包括在内，运种现象被称为假型。最常用的包膜蛋白是水泡性口 炎病毒糖蛋白（VSVG)，其赋予慢病毒载体病毒颗粒稳定性和广泛的亲嗜性(6)。
[0006] 在所述转移载体中包含的所述必要的顺式作用元件包括所述HIV-I长末端重复序 列化TRs)，所述RNA包装信号（W )，W及优选地所述Rev应答元件(RRE)。所述LTRs包含转录、 逆转录和所述载体基因组整合所需要的序列。在自我失活(SIN)的转移载体中几乎所有的 病毒3'端U3区域都被移除W消除其启动子和增强子的活性(3)。逆转录的机制为两个前病 毒的U3均来源于所述RNA基因组的3'LTR，所W用运种载体感染产生的前病毒缺乏LTR驱动 的转录，并且不能在祀细胞中有效地转录它们的全基因组。所述RNA包装信号被认为延伸进 入gag编码序列的启始，但在gag的启始密码子下游引入了一个点突变W防止运一序列中的 大部分被翻译。Rev蛋白在生产细胞内与所述RRE相互作用W稳定转录本、促进RNA从细胞核 转运，并增强RNA包装进入病毒颗粒(7;8)。非必要但常用的顺式作用元件包括一 HIV-I衍生 的中央多聚嚷岭区（cPPT)，其增强了不分裂细胞的转导(9)及一啄木鸟肝炎病毒转录后调 控元件(WPRE)，其通过改进多聚腺巧酸化的效率提升了病毒滴度和转基因的表达。
[0007] 在一标准的第=代慢病毒载体中运些顺式作用元件与所述转基因表达框一起在 祀细胞中被逆转录，导致产生包含各自含有23化P的HIV-IDNA的两个SIN LTR、一个含有 490bp HIV-IDNA的Gag区的引物结合位点（PBS)、一个含有858bp HIV-IDNA的RRE及一个含 有69bp HIV-IDNA的多聚嚷岭(PPT)区的化f的前病毒，递送到祀细胞中的HIV-IDNA总共为 1889bp。运些病毒顺式作用元件与所述转基因表达框共价结合并且在转导后在祀细胞中持 久存在。如果用到一整合性慢病毒载体，它们会被不可逆地整合进祀细胞染色体。
[0008] 转移载体顺式作用元件在祀细胞中持久存在的后果
[0009] HIV-I衍生的顺式作用元件在祀细胞中长期持久存在对慢病毒载体的实际应用产 生了一些在实验上被观察到并且在理论上可能的问题，实际应用设及研究在细胞培养或动 物模型上研究被转移的基因的生物学效应、转基因动物种类和稳定细胞系的构建及转移治 疗用基因来治疗人的疾病。
[0010] 首先，所述转移载体的顺式作用元件含有具备活性的剪接受体位点，其能够与宿 主细胞基因发生剪接形成异常的融合转录本（11-13)。一类运种事件在基因治疗的临床试 验中被观察到，其中一个拷贝的病人的促进生长的HMGA2基因与整合的慢病毒前病毒之间 发生剪接，导致了 HMGA2的转录调控的异常和转导的细胞的大量无性扩增(14)。
[0011] 第二，RNA包装所需的顺式作用元件的持久性存在能够使细胞中表达病毒蛋白的 自我失活的慢病毒载体基因组再活化(15)。如果用在感染HIV的病人体内，运可能会导致慢 病毒载体前病毒再活化及与野生型HIV-I基因组的重组。
[001^ 第；，慢病毒顺式作用元件含有不被转录的CpG富集的DNA，易发生DNA甲基化并可 能在宿主细胞中通过沉默对被投送的转基因表达的减少产生贡献(16)。
[0013] 第四，大段染色体外DNA载体的非转录区在体内已经与转基因的沉默联系在一起 (17)。因此减少染色体外整合缺陷的慢病毒载体(IDLV)内的所述非转录区的大小可能会在 运些载体的应用中改善长期表达。
[0014] 第五，减少所述逆转录产物的大小可能会增加慢病毒载体携带转基因的载量。慢 病毒的生命周期中潜在地有多个阶段，运限制了载体基因组的大小，例如RNA包装（18)，在 胞内dNTP浓度较低的细胞类型中逆转录(19)及整合进入染色体。
[0015] 祀细胞内前病毒的顺式作用元件的最小化
[0016] 已经采取了几种手段来实现最小化持久地存在于祀细胞前病毒中的病毒顺式作 用元件运一目标。
[0017] 首先，一些作者已经研究了简单的删除和点突变来移除或失活残留的顺式作用元 件的效果。化i等人报道了对位于Gag上游的HIV-I主要剪接供体(MSD)进行点突变W及在此 基础上进一步增加的对Gag和RRE元件的缺失产生了一种含有550bp HIV-I顺式DNA(或 786bp，如果把前病毒中的两个LTR也算在内的话)的转移载体(20)。在生产细胞293T中运些 改变导致未剪接的转移载体RNA的表达大幅降低，但在TE671细胞中运一效果由于细胞类型 特异性的剪接模式而不那么明显，并且导致的滴度的降低只有2倍。运个系统还未被本领域 广泛采用，可能是因为滴度下降与不常见的生产细胞系两者结合。Kotsopoulou等人报道了 通过优化包装质粒的密码子和从转移载体中删除RRE来产生一不依赖Rev的慢病毒载体，导 致了滴度下降了5倍(21)。自此开始报道转移载体RNA有效包装进病毒颗粒需要Rev/RRE系 统（8) Jolde j等人报道了最小化PPT上游的化f编码序列的量(22)。该整段序列，即一直到 紧接PPT上游的5个胸腺喀晚碱基区为止似乎都是非必要的。
[0018] 第二种最小化祀细胞前病毒内的顺式作用元件的手段为设计载体，其中运些元件 存在于病毒RNA基因组中但随后在逆转录或整合时被删除。
[0019] Delviks等人报道了一种gamma逆转录病毒载体，其中所述RNA包装信号的两侧为 一段单纯瘤疹病毒胸巧激酶基因化SV-TK)的701bp的重复序列（23)。在祀细胞内发生逆转 录的过程中，通过逆转录酶从一段重复序列到另一段的模板转换导致了所述RNA包装信号 的删除。由于模板转换不是逆转录酶所一定具有的活性，运种缺失的效率被报道为克隆的 91 %。运种删除顺式作用元件的策略具有的弊端是需要引入新的顺式作用元件(在运里是 HSV-TK)，而其自身不被删除。衍生自运个载体的专利和专利申请包括US5741486、 US5714353和W095/032298eSrinivasakumar在一慢病毒载体中使用了一种相似的策略，其 中所述RRE的两侧是重复的多拷贝潮霉素憐酸转移酶基因，导致了 84%的克隆中所述RRE缺 失。
[0020] Torne-Celer等人利用逆转录病毒整合酶的切割内部att位点的能力来产生al地a 逆转录病毒载体，其中5 ' LTR和所述RNA包装信号在整合的3 '末端加工过程中被病毒的整合 酶从前体整合复合物中被切掉(25)。虽然该报道中61%的克隆携带有预期的缺失，内部att 位点加工似乎产生了异质性的前病毒产物并且致使滴度与更常规的al地a逆转录病毒载体 所预期的滴度相比降低了 IO2-IO3倍(26)。
[0021] 第=种最小化慢病毒顺式作用元件的手段为在转导后从祀细胞前病毒中将它们 移除。Luche等人报道了一慢病毒载体，其中所述RNA包装信号的两侧为IoxP位点，运样当在 祀细胞W反式提供Cre重组酶时其可W被切除（27)。在转导后的293T细胞中，所述切除在 12-20%的转导细胞中能够成功。Fang等人报道了一自我最小化的慢病毒载体，包括一Cre 重组酶表达框，其在祀细胞转导后切割所述RNA包装信号、RRE和其自身（28)。通过检测Cre 表达丧失确证成功的切割在92%的祀细胞中发生。运两种策略都依赖Cre重组酶在祀细胞 中的成功表达和发挥功能，并且运样的一种策略在近期不太可能被批准在病人体内使用。 发明概要
[0022] 本发明的发明人通过另一种方法来寻求在祀细胞前病毒中最小化顺式作用元件 W减少与把细胞内转移载体顺势作用元件相关的弊端。
[0023] 在现存的慢病毒载体中，诸如所述RNA包装信号和所述RRE的顺式作用元件位于两 个病毒的LTR之间，因此在被逆转录的基因组区域内。在本发明所描述的载体中，运些顺式 作用元件位于所述3'LTR的下游。运些元件因此存在于病毒RNA基因组中，运样其可被包装 进入病毒颗粒，但在被逆转录的基因组区域W外，所W也不在祀细胞的载体DNA中。
[0024] 相应地，在本发明一第一方面，提供了一逆转录病毒载体，其包含一引物结合位 点，一长末端重复序列和一RNA包装序列，其中所述RNA包装序列位于所述长末端重复序列 的3'端且使得起始于所述引物结合位点的逆转录不会造成所述RNA包装序列被逆转录进入 祀细胞内的载体DNA中。换言之，所述载体的逆转录导致所述RNA包装序列被排除在祀细胞 内产生的逆转录产物W外。在运个载体中，无长末端重复序列位于所述RNA包装序列的3' JLjJU 乂而。
[0025] 所述逆转录病毒载体可基于任何合适的能够投送遗传信息至真核细胞中的逆转 录病毒。例如，所述逆转录病毒载体可W是一 al地a逆转录病毒载体、一 gamma逆转录病毒载 体、一慢病毒载体或一泡沫逆转录病毒载体。运些载体已在基因治疗和其他基因投送应用 中被广泛使用。在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体是一慢病毒载体。在一些例子中， 所述逆转录病毒载体可W基于HIV-I。
[0026] 所述载体包含一引物结合位点(PBS)。运个点结合一tRNA引物，所述tRNA引物负责 启始逆转录过程中负义链合成。所述引物结合位点可位于在所述长末端重复序列的5'或3' 端的位置。优选地，运个引物结合位点位于靠所述载体的5'末端。优选地，所述引物结合位 点位于所述长末端重复序列5 '端一侧。
[0027] 在一些实施方案中，所述载体包含一第二引物结合位点。优选地，其位于所述长末 端重复序列化TR)的3'端一侧。在一些实施方案中，运两个引物结合位点被称为5'引物结合 位点和3'引物结合位点。在一些实施方案中，所述第二引物结合位点位于在3'一侧上紧接 所述LTR。优选地，所述第二引物结合位点位于所述LTR和所述RNA包装序列之间，运样所述 RNA包装序列位于所述第二引物结合位点的3 '端。
[0028] 所述引物结合位点结合一 tRNA引物，所述tRNA引物负责启始逆转录过程中负义链 的合成。所述引物结合位点在所述逆转录过程中还为正义链提供了同源性。
[0029] 所述载体包含一长末端重复序列化TR)。优选地，其位于靠所述载体的3'末端(虽 然一些组件，如所述RNA包装序列，可能位置更靠近所述载体的3 '末端）。
[0030] 在一些实施方案中，所述载体包含两个长末端重复序列，被称为5'LTR和3'LTR。所 述5 ' LTR位于靠所述载体的5 '末端(尽管可能有组件更靠近5 '末端）。当存在有两个LT則寸， 所述引物结合位点优选地位于所述5'LTR的3'一侧(但在所述3'LTR的5'一侧）。所述引物结 合位点可位于3 '端一侧紧接所述5 ' LTR。
[0031] 逆转录病毒LTR通常被片段化为U3，R和呪区。然而，在某些LTR中，运些区域中的部 分可能被删除。术语"长末端重复序列"或LTR)意在覆盖所有运类LTR中的变化。所述LTR参 予逆转录过程，运样载体DNA在祀细胞中基于所述载体RNA产生。LTR可包含一些基因表达所 需的信号，如一转录增强子，一启动子，一转录启始信号和/或一多聚腺巧酸化信号。
[0032] 所述LTR可为一自我失活(SIN)的LTR。在所述载体中，为了提高安全性所述LTR优 选地为一自我失活的LTR，其中U3区的核巧酸已被删除。运可W包括TATA框和转录因子结合 位点。所述删除在祀细胞中逆转录发生后被转移到所述5'LTR，导致了在所述前病毒中的所 述LTR的转录失活。
[0033] 当所述载体包含两个LT則寸，两者可能都是SIN LTR。所述5'LTR的U3区可被一启动 子替换，如巨细胞病毒(CMV)或Rous肉瘤病毒(RSV)启动子。运导致了不依赖于化t的转录， 但仍维持高水平的表达。如上，所述3 'LTR中的部分核巧酸已从所述U3区被删除。SIN LTR为 本领域技术人员所熟知（例如，见Re化oviruses.Edited by Coffin JM,Hu曲es SH,and Varmus HE.Cold Spring Harbor(NY):Col