生物感受器的稳定用于体内应用
【专利说明】生物感受器的稳定用于体内应用
[0001] 本申请是申请人于2010年10月25日提交的题为"生物感受器的稳定用于体内应 用"的中国专利申请201080059122.8的分案申请。
[0002] 本发明涉及制剂用于稳定分离的蛋白质的用途。具体而言，公开了该制剂用于稳 定生物化学感受器中受体的用途。本发明还涉及含有此类制剂的生物化学感受器。
[0003] 经常期望蛋白质的技术应用，以从干扰杂质中释放它们。使用纯化的蛋白质的重 要领域是生物化学感受器。用作生物化学感受器的受体的蛋白质必须对分析物具有高亲和 力。为了检测分析物与受体的结合，经常修饰受体，以使得分析物与受体之间的相互作用是 可以测量的。杂质致使定向修饰困难，且经常是不可能的。因此，从天然细胞和组织中提取 蛋白质并进行纯化。
[0004] 然而，蛋白质的纯化具有缺点，分离的蛋白质的稳定性经常比其在天然环境中的 稳定性低。加入分子伴侣、氨基酸、蛋白质（例如，BSA)、多糖或多糖衍生物经常提高分离的 蛋白质的稳定性。经常地，使用低或高分子量的添加剂，以减少溶液中的自由体积（"分子拥 挤"）。在这种情况下，可使用蛋白质、多糖或合成的聚合物。从现有技术看，尤其是聚乙二 醇、Ficoll、葡聚糖、核糖核酸酶和牛血清白蛋白是已知的。可通过"排除体积"的效果阐明 这些添加剂的效果（Chebotareva 等，2004，Biochemical Effects of Molecular Crowding,Biochemistry(Moscow),69:1522-1536)〇
[0005] 本发明的目标因此是提供制剂，其使得分离的蛋白质的稳定得以提高。通过专利 权利要求书及下文中描述的实施方案实现该目标。
[0006] 本发明因此涉及细胞裂解物级分用于稳定分离的蛋白质的用途，其中通过这样的 方法产生细胞裂解物级分，所述方法包括步骤：
[0007] a)从细胞中产生细胞裂解物;和
[0008] b)从所述细胞裂解物中分离出分离的蛋白质，由此获得用于稳定所述分离蛋白质 的细胞裂解物级分。
[0009] 优选地，从直立刀豆(Canavalia ensiformis)中产生分离的蛋白质和细胞裂解物 级分。特别优选地，细胞裂解物级分含有前刀豆球蛋白（precanaval in)。优选地，分离出分 离的蛋白质后，进一步加工所述细胞裂解物级分。优选地，所述分离的蛋白质是受体，非常 特别优选伴刀豆球蛋白A。优选地，分离的蛋白质是生物化学感受器的组分。特别优选地，所 述生物化学感受器还包含水凝胶颗粒中的葡聚糖和伴刀豆球蛋白。
[0010]通过提供稳定分离的蛋白质的细胞裂解物级分的方法可获得本发明使用的细胞 裂解物级分，所述方法包括步骤
[0011] a)从细胞中产生所述细胞裂解物;和
[0012] b)分离出待从所述细胞裂解物中分离的蛋白质。
[0013] 在该申请中，认为"细胞"表示所有的原核或真核细胞，其表达待分离的蛋白质。这 包括遗传转化的细胞，其中以重组方式表达待分离的蛋白质。细胞可以原核或真核细胞培 养物的单个细胞存在或以动物或植物体或真菌的组织样品形式存在。
[0014] 用于产生细胞裂解物的方法为本领域技术人员所熟知。可在本发明方法范围内使 用所有已知的机械或非机械破碎方法破碎细胞。优选的机械破碎方法是使用旋转刀片匀浆 (在动物细胞中）、P〇tter-Elvehjem方法、研磨细胞或组织、在研钵中用沙子磨碎、氧化错或 玻璃珠、在超声的情况下通过空化力进行细胞破碎，和通过狭窄阀门的高压挤压细胞悬浮 液(例如在French Press中）。本领域技术人员知道，在机械破碎方法中，以这种方式可形成 热，以至于在许多情况下需要温控，以防止蛋白质变性。优选的非机械破碎方法是细胞的反 复冰冻和融化、利用低渗溶液处理细胞、在革兰氏阳性菌的情况下利用溶菌酶进行处理、利 用EDTA进行处理，随后在革兰氏阴性菌的情况下与溶菌酶温育、或在酵母的情况下利用甲 苯进行处理。当然，所述方法的多种要素可与另一种方法或此处未提及的其他破碎方法组 合。
[0015] 在破碎过程中，必须保护蛋白质免于有害影响。优选地，使用冷或特异的抑制剂， 以防止蛋白酶对蛋白质的降解。为了保护巯基，优选使用还原剂，特别优选二硫苏糖醇或二 硫赤藓糖醇。为了保护免于重金属离子，优选乙二胺四乙酸(EDTA)。这也结合可激活蛋白酶 的二价阳离子。为了防止蛋白质凝集，优选使用非离子型去污剂。
[0016] 优选地，任选采取的破碎方法和任何保护措施不仅适合于在细胞裂解物中以活性 形式存在的想要的蛋白质，还适合于所述细胞裂解物的组分，其介导蛋白质的稳定，所述蛋 白质也必须不能在功能上被所选破碎方法损坏。
[0017] 在其实际应用前，分离的蛋白质在许多情况下是被修饰了的。例如，用于生物化学 感受器的受体经常被标记。通过共价修饰受体，例如使用荧光染料进行该标记。为了待稳定 的经修饰的分离蛋白质不被细胞裂解物级分中存在的非修饰蛋白质稀释，优选从所述细胞 裂解物中分离待分离的蛋白质。表述"分离待从细胞裂解物中分离的蛋白质"表示纯化想要 的蛋白质。结果，存在至少一种细胞裂解物，其含有蛋白质作为分离的蛋白质。此外，单独存 在至少一种细胞裂解物级分，其不含有上述蛋白质或仅含有很少量的上述蛋白质。从其天 然环境，即从这样的分子中分离所述分离蛋白质，其与所述分子一起存在于细胞裂解物中。 优选地，基于来自其天然环境的分子，所述分离的蛋白质以至少50%、至少75%、至少80%、 至少90%、至少95%，或特别优选地，至少99% (重量/重量)的纯度存在。含有分离的蛋白质 的细胞裂解物级分可含有任何想要量的分子，其不来自所述蛋白质的天然环境，却是在纯 化过程中或在纯化后添加进去的。其一个实例是所用缓冲液的组分。
[0018] 用于从细胞裂解物中分离待分离的蛋白质的方法为本领域技术人员所知。优选方 法是沉淀和差异增溶、超速离心、层析方法和电泳。
[0019]优选通过加入升高浓度的硫酸铵完成蛋白质的沉淀。根据所达到的硫酸铵浓度， 以这种方法可连续沉淀出不同溶解度的蛋白质级分，并且可进行分离。同等优选的是通过 使用合适的缓冲液酸化培养基来沉淀蛋白质。
[0020] 超速离心基于这样的原理，在离心产生的重力场内，颗粒密度越高并且越紧密，其 沉降得越快。因为足够长离心过程中建立的离心力和浮力之间的平衡，各蛋白质在容器中 在浮力和离心力彼此平衡的点上积聚。使用蔗糖梯度可利于该方法。
[0021] 层析分离蛋白质基于这样的原理，所述蛋白质溶解在流动相中，优选缓冲液中，移 动经过静止相。以这样的方式选择相，其中来自蛋白质混合物的不同浓度的各蛋白质与固 相之间的相互作用产生各蛋白质级分经过静止相的不同长度的流动时间。蛋白质与静止相 怎样相互作用的方式取决于层析的类型。用于分离蛋白质的优选层析方法是大小排阻层析 (基于待分离的各蛋白质的不同大小）、亲和层析(基于各蛋白质特异性结合柱材料的能 力）、离子交换层析(基于多种蛋白质的不同等电点）和反相层析(基于多种蛋白质的不同疏 水性）。
[0022] 在本专利申请的范围内，表述"分离的蛋白质"表示任何蛋白质，其中对其功能状 态的分离具有兴趣。下文中，同义使用表述"想要的蛋白质"。本申请的上下文中，分离的蛋 白质优选包含酶、受体、调节性蛋白质、转录因子、细胞骨架蛋