牛psma5基因rna干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因生物领域，具体设及一种牛PSMA5基因 RNA干扰载体的构建与筛选 及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达。
【背景技术】
[0002] PSMA5基因具有多种生物学功能，它是26s蛋白酶体的组成元件，26s蛋白酶体负责 细胞大多数蛋白质的降解，它是生物体内的重要降解途径，关系到很多生物进程。在之前的 蛋白组学研究中发现，PSMA5在乳腺的共辆亚油酸(CLA)内源性合成中表达上调，因此推测 PSM5可能参与CLA的内源性合成。
[0003 ] CLA是亚油酸的同分异构体，是一系列含有碳8、9、10、11开始的共辆双键，具有位 置和几何异构的十八碳二締酸的异构体的总称。CLA是近几十年来，在反当动物中发现的一 种对人体有益的功能性不饱和脂肪酸。它具有令人瞩目的生理活性，如抗癌、抗动脉硬化 症、抗糖尿病、提高免疫力、改善骨组织代谢、抑制脂肪沉积等生物学功能。因此，如何提高 CLA合成的含量成为近几十年来国内外的一个研究热点。在自然界CLA主要Wcis-9，trans-11 CLA的形式存在于反当动物的乳制品和肉制品中。前期的研究可知牛奶中CLA主要通过 乳腺中内源性合成而来，但是其合成机制还不明确。目前的研究仅仅知道TVA可W通过硬脂 酷辅酶A去饱和酶SCD的去饱和作用转化成CLA，但除了 SCD W外还可能存在其他的蛋白参与 并调控CLA的合成。尽管W现有的营养调控手段可W提高牛奶中CLA的含量，但是其含量还 远不能发挥CLA的最佳生理功效。因此只有对乳腺中CLA合成的调控机制进行深入的研究， 明确乳腺中内源性合成化A的机制，才能利用分子营养学手段来进一步提高乳中化A的含 量。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了牛PSMA5基因 RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛 乳腺上皮细胞中的表达。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0006] 牛PSMA5基因 RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达，包括如 下步骤：
[0007] Sl、在NCBI上查询牛PSMA5基因的CDS区序列，根据ShRNA的设计原则在invi化Ogen 的ShRNA在线设计网站上设计PSMA5基因的ShRNA祀序列；
[000引 S2、选择4条合适的ShRNA祀序列W及一条阴性对照序列，根据pLVX-shRNA2-puro 质粒的酶切位点W及ShRNA的设计原则在选择的ShRNA祀序列上加上酶切位点、茎环结构和 终止转录的序列，送到华大基因合成；
[0009] S3、将正义链（100uM)5ul;反义链（100uM)5ul; IOX退火缓冲液加1;d地20 35ul混 合后置于水浴锅中，95°C加热5min后，关闭水浴锅自然降溫至30°CW下，取样电泳，切胶回 收退火产物，置于-20°C备用；
[0010] S4、用EcoRI、BamHI限制性内切酶双酶切pLVX-shRNA2-puro空质粒，37°C，地，酶切 体系如下：pLVX-shRNA2-puro空质粒20ul ;EcoRI限制性内切酶Iul ;Ba恤I限制性内切酶 Iul; IOX CutSmart缓冲液加 l;dd肥0 23ul;
[0011] S5、将所得退火产物与所得的双酶切的pLVX-shRNA2-puro空质粒用T4 DNA连接酶 连接，16°C，过夜；
[0012] S6、将测序正确的菌液进行无内毒素质粒大提，提取的质粒W备转染细胞;将magi'细胞培养到汇合度为80%时，传代到6孔板中，24h后进行细胞转染 ，按照 1 ipof ectamine?2000说明操作，转染4她后检测巧光；
[0013] S7、收集转染后4她的细胞，提取RNA，-80°C备用，筛选出最有效的ShRNA重新转染 细胞，待细胞汇合度大于90 %后，更换分化培养基;分化培养4days后提取RNA和总蛋白，-80 °C备用；
[0014] S8、在NBCI上找到牛的内参基因 e-act in和PSMA5的CDS区序列，用primer premie巧软件设计引物，送华大基因合成，引物序列如下：
[0015]
[0016]
[0017]
[001 引
[0019] 反应体系如下：2X !^istStart Universal SYBR Green Master(Rox) IOul;引物 (上）0.4ul;引物（下）0.4ul;模板cDNA lul;d地20 8.化 1;
[0020] S9、按照如下程序进行实时巧光定量PCR:
[0021] 首先在95°C运行2min，之后40个PCR循环(95°C IOs; 60°C34s);之后95°C Imin; 55°C 30s；95°C30s；
[0022] SIO、采用法计算巧光定量结果，在4条设计的ShRNA序列中选取干扰效率最 高的一条，再转染细胞，进行后续的Western blotting检测。
[0023] 其中，所述步骤S5中的连接体系如下：退火产物lul;化VX-shRNA2-puro双酶切产 物Iul; T4 DNA连接酶Iul; IOX T4 DNA连接酶缓冲液Iul; d地20 6ul。
[0024] 其中，所述Western blotting检测包括如下步骤:首先将总蛋白用BCA试剂盒进行 浓度测定，按每孔IOug的量上样，电泳时间为70v，3小时；120V，2小时；采用半干转方法， 15v，45min，将目的蛋白转印到硝酸纤维素膜(NC)上;采用5%脱脂奶粉封闭化，一抗4°C过 夜解育；然后用TBST洗S次，每次15分钟；再解育二抗，室溫3小时；最后用ECL发光液显影， 用化non Gis软件进行灰度值分析。
[0025] 其中，所述一抗为GAPDH(abl81603，1:10000，3化Da;Abeam)，PSMA5( 1: 5000，27邸； cell signaling)。
[00%]其中，所述二抗为Goat anti-feAbit IgG-H&L(ab6721,1:3000;Abeam)。
[0027] 本发明具有W下有益效果：
[0028] 构建了PSMA5基因 RNA干扰载体，转染奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)，并利用实时巧光 定量PCR及western blotting的方法分别在mRNA和蛋白水平检测PSMA5基因的表达情况，为 进一步掲示PSM5在乳腺的CLA内源性合成中的作用提供技术依据。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明实施例中重组RNA干扰载体测序图。
[0030] 图2为本发明实施例中PSMA5 mRNA水平相对表达量，
[0031] 图中，A:细胞转染4她后PSMA5 mRNA水平相对表达量B:分化4d后PSMA5 mRNA水平 相对表达量。
[0032] 图3为本发明实施例中PSMA5蛋白水平相对表达量。
【具体实施方式】
[0033] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，W下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0034] 实施例
[0035] 本实施例所使用的奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)由韩国李洪求教授实验室所赠。
[0036] 本实施例所使用的试剂如下：
[0037] DMEM/HIGH 化UCOSE、Penicillin-Streptomycin Solution、胎牛血清购自 HyClone公司，氨化可的松、膜岛素、催乳素 、RIPA lysis buffer购自sigma公司，0.25%-T巧psin 2.21mM 抓TA、DPBS购自CORNING公司，M-MLV Reverse Transcrip化se、dNTP Mix、 01igo(dT)15 P;rime;r、RecombinantRNasin@Ribonuc lease Inhibito;r、T4 DNA Ligase、BamHI限制性内切酶、EcoRI限制性内切酶、6曰3*邱?凝胶及PCR回收试剂盒、质粒小 提试剂盒购自Promega公司，DNA纯化试剂盒、D2000 marker、无内毒素质粒大提试剂盒购自 天根公司，TRlzol?Reagent、lip〇fectamine?2〇〇〇购自 invitrogen公司，pLVX-shRNA2- puro质粒购自优宝生物公司，F'astStart Universal SYBR Green Master(ROX)购自罗氏公 司，primary antibodies:PSMA5贝勾自cell signaling公司，primary antibodies：GAPDH, polyclonal secondary antibody：Goat anti-Rabbit IgG-H&L贝勾自abeam公司，ECL显影试 剂盒购自化ermo公司。
[0038] 本实施例中牛乳腺上皮细胞MAC-T生长培养基为DMEM/HI GHGLUC0SE化yClone) + 10%胎牛血清巧OOul膜岛素（5iig/iil)巧OOul氨化可的松（lyg/iU ) + 1 %青霉素-链霉素 (lOOIU/ml青霉+100μg/ml链霉素）。分化培养基为DMEM/HI GHGLUC0SE化yClone)W%胎牛 血清巧OOul膜岛素（5iig/yl)巧OOul氨化可的松（lyg/iU)巧OOul催乳素（5ug/ul)+l%青霉 素-链霉素（lOOIU/ml青霉+lOOμg/ml链霉素）。
[0039] Sl、在NCBI上查询牛PSMA5基因的CDS区序列，根据ShRNA的设计原则在invi化Ogen 的ShRNA在线设计网站上设计PSMA5基因的ShRNA祀序列；
[0040] S2、选择4条合适的ShRNA祀序列W及一条阴性对照序列，根据pLVX-shRNA2-puro 质粒的酶切位点W及ShRNA的设计原则在选择的ShRNA祀序列上加上酶切位点、茎环结构和 终止转录的序列，送到华大基因合成；
[0041 ] S3、将正义链（100uM)5ul;反义链（100uM)5ul; IOX退火缓冲液加 1;d地20 35ul混 合后置于水浴锅中，95°C加热5min，之后关闭水浴锅自然降溫，溫度降至30°CW下，取样电 泳，切胶回收退火产物，置于-20°C备用；
[0042] S4、用EcoRI、BamHI限制性内切酶双酶切pLVX-shRNA2-puro空质粒，37°C，地，酶切 体系如下：pLVX-shRNA2-puro空质粒20ul ;EcoRI限制性内切酶I