一种水体微生物定性与定量的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及一种水体微生物定性与定量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 水体微生物是水体质量的指标，也是人畜病原菌的重要来源，因此，水体微生物精 确地定性与定量检测与监控是十分必要的。
[0003] 现有水体微生物定性与定量检测技术包括形态学计数、忍片检测、16S rRNA测序、 宏基因组测序和实时定量PCR^olymerase化ain Reaction,聚合酶链式反应）。形态学计 数检测需要对微生物进行预培养，耗时长，不可培养微生物不可检测，一次仅能够检测一种 微生物，通量低，在计数时抽样量有限，且结果粗糖，无法对种W下的分类单元进行区分。忍 片检测所需的待测样品的DNA量大，需要对微生物进行预培养及富集处理，检测结果不准 确，且无法做定量检测。16S rRNA测序无法对种W下的分类单元进行区分。宏基因组测序深 度有限，对于低含量的微生物的定量检测准确度很差。实时定量PCR-次只能检测一种微生 物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，无法计算微生物定性与定量的可靠性，使得结论实 用性差。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中微生物定性与定量检测不准确的问题，本发明实施例提供了 一种水体微生物定性与定量的检测方法。所述技术方案如下：
[0005] 本发明实施例提供了一种水体微生物定性与定量的检测方法，所述方法包括：
[0006] 确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、W及不存在于所 述待测样品中的参考微生物，所述待测样品为水体；
[0007] 根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物 的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和 所述参考微生物的特征区域；
[000引制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微 生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第=多重扩增 引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第S多重扩增引物混合得 到混合多重扩增引物；
[0009] 向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；
[0010] 提取所述混合样品的核酸；
[0011] 利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产 物；
[0012] 利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；
[0013] 根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和 定量分析。
[0014] 具体地，所述目标微生物类群的数目含I个，且每个所述目标微生物类群包括> 0 种所述目标微生物；
[0015] 所述目标微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、 藻类和原生动物中的至少一种；
[0016] 所述参考微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、 藻类和原生动物中的至少一种。
[0017] 具体地，所述确定待测样品中的非目标生物的方法包括:将所述非目标生物确定 为除所述目标微生物类群之外的所有生物，若能获得所述目标微生物类群的特征区域，贝U 所述非目标生物指除所述目标微生物类群之外的所有生物;若不能获得所述目标微生物类 群的特征区域，则所述非目标生物指所述混合样品中，除所述目标微生物类群之外的其它 生物。
[0018] 具体地，所述目标微生物类群的特征区域为所述目标微生物类群内的微生物的参 考基因组上的核酸序列;所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述参考基因组 中为单一序列;所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述目标微生物类群内不 同微生物间保守;所述目标微生物类群的特征区域的区分度> 3;
[0019] 所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的特征区域同源;所述目标微 生物的特征区域的m2值含2，其中，m2值为所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类 群内除所述目标微生物外的其它所述微生物间的差异碱基数的最小值；
[0020] 所述参考微生物的特征区域为所述参考微生物的参考基因组上的核酸序列;所述 参考微生物的特征区域的两侧的序列在所述参考微生物的参考基因组中为单一序列;所述 参考微生物的特征区域的两侧的序列在除所述参考微生物外的其它生物中不具有同源性。
[0021] 进一步地，所述区分度是指由同一所述混合多重扩增引物扩增的任一所述目标微 生物类群的特征区域与任一非特征区域间的差异碱基数的最小值，其中，所述非特征区域 是所述混合多重扩增引物W所述混合样品的核酸为模板的扩增产物，且所述非特征区域不 为所述目标微生物类群的特征区域，若无所述非特征区域，则所述区分度= 3XL1/4,其中， Ll为所述目标微生物类群的特征区域的核酸序列长度。
[0022] 具体地，在提取所述混合样品的核酸时，若所述待测样品中核酸的含量过低，则在 提取所述混合样品的核酸的过程中，加入所述混合多重扩增引物不能扩增的外源核酸。
[0023] 具体地，所述目标微生物类群和所述目标微生物的定性分析方法如下：
[0024] 将所述高通量测序片段与每种所述目标微生物类群的特征区域进行比对，当差异 碱基数含nl时，则比对成功，相应的所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征区 域，其中，nl为所述目标微生物类群的特征测序片段的最大容错碱基数;若比对成功的所述 目标微生物类群的特征区域含1种时，则判断所述高通量测序片段为所述目标微生物类群 的特征测序片段；
[0025] 将所述目标微生物的特征区域与每种同源的所述目标微生物类群的特征区域进 行比对，在所述目标微生物的特征区域中提取差异碱基组成所述目标微生物的标准基因 型;在所述目标微生物类群的特征测序片段上，提取所述目标微生物的标准基因型所对应 的碱基，组成所述目标微生物的测试基因型；若所述目标微生物的测试基因型与所述目标 微生物的标准基因型的差异碱基数含n2,其中，n2为所述目标微生物的特征测序片段的最 大容错碱基数，则所述目标微生物的测试基因型所在的所述高通量测序片段为所述目标微 生物的特征测序片段；
[0026] 将所述参考微生物作为仅包含一个所述目标微生物的所述目标微生物类群，计算 获得的所述目标微生物的特征测序片段，即为所述参考微生物的特征测序片段；
[0027] 若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5含巧，则判断所述待测样品 中存在所述目标微生物类群，其中，a5为概率保障;若所述目标微生物类群的特征测序片段 存在的概率P5<a5，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物类群；
[0028] 若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6 > a6，则判断所述待测样品中存 在所述目标微生物，其中，06为概率保障;若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6 如6，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物；
[0029] nl使得Pl含al且P3含03,其中，Pl为一条不是所述目标微生物类群的特征测序片 段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阳性 的概率;P3为一条所述目标微生物类群的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物类群 的特征测序片段而产生的假阴性的概率;Ql和03为判断阔值；
[0030] n2使得P2如2且P4如4,其中，P2为一条不是所述目标微生物的特征测序片段的 所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物的特征测序片段而产生的假阳性的概率;P4 为一条所述目标微生物的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物的特征测序片段而 产生的假阴性的概率;02和a4为判断阔值；
[0031] P5 = 1-BIN0M. DIST(Sl) SI, Pl ,FAL沈），P6 = 1-BIN0M. DIST(S3, S3, P2, FALSE), Sl 为所有的所述目标微生物类群的特征区域的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量 的中位数;S3为所有的所述目标微生物的特征区域的所述目标微生物的特征测序片段的数 量的中位数，FALSE为参数值;BINOM. DIST函数返回一元二项式分布的概率。
[0032] 进一步地，所述目标微生物类群和所述目标微生物的定量分析方法如下：
[0033] 所述目标微生物类群的量Ml =Mr X S1/S2，所述目标微生物类群的量的置信区间 为[Ml 1，M12]，其中，Mr为加入所述待测样品中的所述参考微生物的量;S2为所有的所述参 考微生物的特征区域的所述参考微生物的特征测序片段的数量的中位数;Mll和M12分别为 Ml值的置信区间的下限与上限；
[0034] 所述目标微生物的量M2 = M1XS3パ1，所述目标微生物的量的置信区间为[M21， M22]，M21和M22分别为M2值的置信区间的下限与上限；
[0035] Ml 1 =Ml X (1-S4/S1) ,M12=M1 X (1+S5/S1) ,M21 =WZ X (1-S6/S3) ,M22=M2 X (1+ S7/S3);其中，S4为假阳性的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量且S4 = CRITBIN0M (nS，Pl，a9)，其中，nS为计算SI的所述目标微生物类群的特征区域的所述多重扩增引物所 扩增的所述非特征区域的所述高通量测序片段的数量;S5为假阴性的所述目标微生物类群 的特征测序片段的数量且S5 = CRITBIN0M(Sl，P3，a9)，其中，a9为概率保障；S6为假阳性的 所述目标微生物的特征测序片段的数量且S6 = CRITBINOM(Sl，P2，al〇)，S7为假阴性的所述 目标微生物的特征测序片段的数量且57 = 〇?口81側1(53，？4,〇10)，其中，〇10为概率保障； CR 口 BINOM函数返回使累积二项式分布大于等于临界值的最小值。
[0036] 进一步地，Pl = BIN0M.DIST(nl，ml，l-E，?UE)，P2 = BIN0M.DIST(n2，m2，l-E, T 抓 6)，口3 = 1-8^(11.0151'(111，1^，￡^抓￡)，口4=1-8^(11.0151'(112，1^2，￡^抓￡)，其中，1111为 所述区分度;所述m2为所述