一种细胞核染色用荧光碳点及其在细胞核成像中的应用及方法与流程

本发明属于纳米材料和生物成像技术领域，具体涉及一种细胞核染色用荧光碳点及其在细胞核荧光成像中的应用及方法。

背景技术

细胞是生命活动中的重要载体，对细胞和外源物质的研究能够帮助我们了解细胞的运输、代谢以及毒性。其中细胞核对于细胞的诸多过程尤为重要，比如代谢、传代与遗传等。然而，相对于细胞核的至关重要性来说，对其研究却是相对缺乏的。对细胞核的染色是第一个步骤，他能够显示出细胞核的形态，这之后才能研究细胞核的运输以及转运试剂到细胞核的情况。随着荧光显微技术的飞速发展，由于其可视化和高分辨特性，对细胞核的荧光染色就变得极为普遍。现在被普遍使用的细胞核荧光染料存在一定的缺陷，比如dapi和hoechst，它们存在自猝灭和易被光漂白的缺点，其中dapi还有一定的细胞毒性。因此，开发能够特异性染色细胞核的新型荧光染料具有重要的意义。

碳点，作为一种新型的荧光纳米材料已被广泛报道，并且有极为广泛的应用，比如细胞成像，生物传感，光电材料等领域。目前发明的碳点在被用于细胞成像时，由于材料的尺寸、表面电荷等性质，很难应用于细胞核的成像，大多数发明的碳点只能进入细胞的细胞质、线粒体等部位，且需要较长的孵育时间。因此，发展一种快速且特异性的对细胞核进行染色的荧光染料具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的发明目的是提供一种细胞核染色用荧光碳点，同时提供将其在细胞核染色中的应用及方法是本发明的又一发明目的。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为：

一种细胞核染色用荧光碳点，所述碳点采用以下步骤制得：

1）将叶酸和间苯二胺溶解在水中加热反应；

2）反应后，离心取上层溶液过硅胶柱层析色谱，收集黄绿色荧光部分，再旋蒸去除有机溶剂后转移至水中，冻干即得。

步骤1）中，所述叶酸和间苯二胺的质量比为1：（1～20）；加热反应的温度为120～240℃，反应时间为3～12h。

步骤2）中，过硅胶柱层析色谱采用的流动相为甲醇和乙酸乙酯的混合液；冻干的具体操作为：先于-16℃冷冻24～48h，后于-60～-75℃冷冻干燥36～48h。

所述水为去离子水或超纯水。

所述的细胞核染色用荧光碳点在细胞核荧光成像中的应用。

所述的细胞核染色用荧光碳点用于细胞核荧光成像的方法，包括以下步骤：

a.将荧光碳点加水溶解，加培养基与细胞共孵育；

b.孵育后，用10～100mm、生理ph范围ph7.2-7.4的磷酸缓冲盐溶液洗掉原培养基，并换上新鲜的培养基在激光扫描共聚焦荧光显微镜下进行荧光成像或孵育后直接在激光共聚焦荧光显微镜下进行细胞核的荧光成像。

步骤a中，共孵育时培养基中荧光碳点的浓度为5～60ug/ml，共孵育时间为1～60min。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明制备的碳点在紫外光激发下发射绿光，有较大的斯托克斯位移，且最佳激发位置与现有商品化的405激光器吻合，能够很好地应用于激光共聚焦显微镜；

2、采用本发明方法制备的荧光碳点属于超小纳米材料，较低的剂量下仍有很好的膜渗透性，能够快速地进入细胞核，并对活细胞的细胞核进行荧光成像；不仅可以用于常规的荧光染料成像步骤，也可用于免洗的细胞核荧光成像；具有较高的细胞相容性，为生物实验提供了很好的基础；在遇到遗传物质dna或rna时，荧光强度能够得到大幅提高，可以选择性的识别dna与rna；相较于已报道过的细胞成像碳点，在用于细胞核成像时，仅需要极低的孵育浓度和极短的孵育时间；

3、本发明采用的装置和试剂廉价、简单，相较于商品化的细胞核染料而言成本极低，适合于任何科研院所及大、小型医院中使用，有很广泛的普及性和社会与经济价值。

附图说明

图1为本发明荧光碳点的透射电镜图；

图2为本发明荧光碳点的吸收光谱，激发光谱，以及在最佳激发下的发射光谱；

图3为本发明以荧光碳点孵育后的细胞核成像共聚焦显微照片；

图4为本发明以荧光碳点孵育后的细胞核三维成像共聚焦显微照片；

图5为本发明以荧光碳点孵育后的细胞核成像pbs洗涤和免洗操作得到的共聚焦显微照片；

图6为本发明以荧光碳点孵育后，以及分别用dna和rna消解酶处理后的hela细胞的细胞核共聚焦显微照片。

具体实施方式

以下采用具体实施方式对本发明做进一步说明。

实施例1

一种细胞核染色用荧光碳点，所述碳点采用以下步骤制得：

1）将5mg叶酸和13mg间苯二胺溶解在5000mg的去离子水中，置于水热反应釜中加热至200℃反应12h；在其他实施例中，叶酸和间苯二胺的质量比在1：（2-20）均可，去离子水的用量满足将原料溶解均可；

2）反应后，离心（去除大颗粒凝集物）取上层溶液过硅胶柱层析色谱，收集黄绿色荧光部分，旋蒸（去除有机溶剂）后转移至蒸馏水中，冻干即得荧光碳点；过硅胶柱层析色谱时采用的流动相为甲醇和乙酸乙酯按体积比1：1的混合液；冻干的具体操作为：先于-16℃冷冻30h，后于-60℃冷冻干燥48h；在其他实施例中，先于-16℃冷冻24~48h，后于-60~75℃冷冻干燥36~48h均可。

利用所述的细胞核染色用荧光碳点在细胞核中荧光成像的方法，包括以下步骤：

a.先将荧光碳点加蒸馏水溶解得到1mg/ml的碳点溶液，添加rpmi1640培养基与hela细胞共孵育，孵育时培养基中荧光碳点的浓度为15ug/ml，孵育时间为10min；在其他实施例中，浓度为5～60ug/ml，孵育时间为1～60min均可；

b.孵育后，直接在激光共聚焦荧光显微镜下进行细胞核的荧光成像，成像时采用波长为405nm的激光器。在其他实施例中，孵育后，可用10-100mm、生理ph范围ph7.2-7.4的磷酸缓冲盐溶液洗掉原培养基，并换上新鲜的培养基在激光扫描共聚焦荧光显微镜下进行荧光成像。

需要指出的是，上述实施例中所述的培养基和细胞仅是作为具体实施方式对本发明进行的说明，并不能依此限定本发明的保护范围，本发明的关键点在于将荧光碳点在细胞核中荧光成像的应用，也即，在其他实施例中，也可替换为其他细胞和培养基，同样可实现发明效果，但需指明的是，采用的培养基必须是该细胞所需要的。

性能测试

对实施例1得到的荧光碳点进行相关性能测试，结果见图1-图6所示。

其中，图1所示为本发明荧光碳点的透射电镜图，从图中可以看出，本发明得到的碳点为较均一的超小尺寸，粒径在1.6-4nm，平均粒径2.4nm。

图2所示为本发明荧光碳点的吸收光谱、激发光谱以及在最佳激发下的发射光谱，从图中可以看出，紫外吸收位置位于395nm，最佳激发下的发射峰位于535nm，激发位置和现有的商品化激光器极为匹配，能够很好的用于激光共聚焦显微镜。

图3所示为本发明以荧光碳点孵育后的细胞核成像共聚焦显微照片，细胞图显示出碳点能很好的进入细胞核，并对细胞核进行荧光影像，很好的显示出细胞核的显微结构。

图4所示为本发明以荧光碳点孵育后的细胞核三维成像共聚焦显微照片，三维细胞结果显示出碳点在整个细胞中几乎只在细胞核部分分布，并且对细胞核进行了荧光影像。

图5所示为本发明以荧光碳点孵育后的细胞核成像pbs洗涤和免洗操作得到的共聚焦显微照片，证明正常操作和免洗操作均能够得到很好的细胞核成像结果。

图6所示为本发明以荧光碳点孵育后，以及分别用dna和rna消解酶处理后的hela细胞的细胞核共聚焦显微照片，酶解核酸的对照进一步证实了碳点对细胞核进行荧光影像的原理：碳点进入细胞后结合的是细胞核中的dna和rna，并且呈现出荧光增强的结果。

对比试验

为了说明发明效果，其他条件相同，将实施例1中的间苯二胺（mpd）换成其结构同分异构体：邻苯二胺（opd）和对苯二胺（ppd）制备荧光碳点，并对得到的碳点进行荧光成像分析。

结果显示，采用邻苯二胺（opd）和对苯二胺（ppd）得到的碳点均无法实现对细胞核的荧光成像，但采用opd显示了对细胞的其他不同部位（如细胞质和线粒体）成像。