近红外发光多肽自组装金纳米材料及其制备方法与应用与流程

本发明属于功能光学纳米材料领域，特别涉及近红外发光多肽自组装金纳米材料及其制备方法与应用。

背景技术：

基因治疗是当代医学和生物学的一个新的研究领域，其通过一定方式将正常基因或有治疗作用的dna序列导入靶细胞，从基因水平调控细胞中的缺陷基因表达或以正常基因矫正、替代缺陷基因来发挥治疗作用。为了达到理想的治疗效果，科学家一直在研究传送质粒dna的有效途径。目前，将质粒dna导入靶细胞的载体主要包括病毒性载体和非病毒性载体，主流的三种病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体以及腺病毒载体，其具有高转染率、持续稳定表达外源基因的特点，但也存在免疫原性、致癌性、宿主dna插入整合等弊端，从而限制了它们的应用。而非病毒基因转染载体研究较多的是人工合成的阳离子聚合物，阳离子高分子的转染效率和分子量成正比，但分子量越高，电荷密度就越大，其相应的细胞毒性也就显著增加，这就限制了高分子量载体的使用，从而制约转染效率的提高。因此，急需开发一种生物毒性低、负载能力强、转染效率高的转染试剂来进一步推进基因治疗领域的发展。

肽分子自组装已经成为分子生物学、化学、医学和材料学等学科的交汇点，它是指在适当的条件下，肽分子间通过非共价键力作用形成具有复杂有序的特定结构并具有某种特定功能的分子聚集体的过程。由天然氨基酸组成的自组装短肽具有良好的低细胞毒性，可控的降解性能，高的运载效率及细胞摄取率，同时还具有降低药物的毒副作用等优点，在纳米生物材料、药物传输释放、蛋白质及基因载体等方面应用较广。但将它作纳米载体材料用于药物或基因治疗过程中其在体内的传递情况及载体自身最终的去向鲜有报道，这是因为自组装多肽本身不具备发光性能无法实现可视化监测，且其组成主要是一些氨基酸，不易于检测，目前无法研究它自身的去向。因此，如何赋予这种具有低细胞毒性及高的负载效率的组装材料以可视化监测属性，在生物工程及基因治疗方面都具有十分重要的意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的提供了一种近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过所述的制备方法制得的近红外发光多肽自组装金纳米材料。所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料具有近红外发光性质，便于可视化研究，而其自组装多肽具有稳定性好，生物毒性低，基因负载能力强的特点。

本发明的又一目的在于提供所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在基因转染和细胞成像方面的应用；本发明的纳米材料基因负载能力强，在质粒转染方面应用性较好，可将带荧光标签的质粒用于转染细胞，可观察转染细胞表达荧光蛋白的情况来研究质粒转染的效果(例如通过共聚焦显微镜)；所述纳米材料由于近红外发光特点，可用于细胞成像的研究，可观察待观察物质在细胞内的分布情况及进出细胞过程(例如通过共聚焦显微镜等)。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

将氯金酸与自组装多肽孵育，加入还原剂静置反应，最后在90～100℃下搅拌反应，当反应液反应至棕黄色时，停止反应，然后透析去除多余的未反应物，最后超滤浓缩，即得所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料。

进一步的，所述多肽结构为cyclo-(arararad)-acp-c，所述成环氨基酸包括4个l型丙氨酸(a)、3个d型精氨酸(r)和1个天冬氨酸(d)，l型氨基酸与d型氨基酸交替相接，所述环肽侧链为与天冬氨酸羧基相连的6-氨基己酸(acp)，其末端再接半胱氨酸；其结构式如式ⅰ所示，该多肽在水中溶解后会通过环肽分子骨架上的c＝o和n-h形成分子之间氢键网络的驱动力作用下自发进行组装：

进一步的，所述的还原剂为还原型谷胱甘肽、还原型半胱氨酸、巯基聚乙二醇中的至少一种。

进一步的，所述的反应液中的氯金酸与还原剂的摩尔浓度比为1:(0.5～1.5)；还原剂与自组装多肽的摩尔浓度比为(10～50):1。

进一步的，所述的反应液的ph为7～12。

进一步的，所述的反应的时间为8～30h。

进一步的，所述的孵育的温度为25±5℃，所述的孵育的时间为30min～60min。

进一步的，在所述的静置反应可调节ph至8～10，例如，可加入naoh进行调节，可进一步优化发光情况。

进一步的，所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在4℃下保存。

如图1最右侧的结构示意图所示，所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料的形貌为组装体，所述的多肽自主装形成中空纳米纤维状结构，金纳米粒子以颗粒状接于所述的纳米纤维上，所述的金纳米单颗粒子粒径为1.5～2.5nm，所述的纳米纤维的长度为200～600nm。

进一步的，所述反应完的产物在ph为6～9的水中透析，可通过naoh等酸碱调节剂对ph进行调节；透析时间为1～4天，所述超滤浓缩使用超滤管的膜孔径为3～50kda。

一种近红外发光多肽自组装金纳米材料，通过所述的制备方法制得。

所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在基因转染和/或细胞成像方面的应用。

所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在基因转染方面的应用，包括负载质粒dna转染细胞，具体方法为：将所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料与质粒dna混合，涡旋后静置得到混合物，将所述的混合物加入40％～60％的细胞密度的待转染细胞中，加入无血清培养基培养进行转染后，吸走培养液，改用含血清的培养基培养进行细胞表达，最后观察细胞荧光蛋白的表达情况。

进一步的，所述的观察细胞荧光蛋白的表达情况可通过本领域常用的技术手段进行观察，例如共聚焦显微镜等。

进一步的，所述质粒可以为带荧光蛋白表达的质粒，可通过共聚焦成像系统对转染效果进行观察；更进一步的，所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白。

进一步的，所述近红外发光的多肽自组装金纳米材料使用的浓度为20nm～150nm，质粒dna用量为1～3μg/ml，转染时间为6～12h，细胞表达时间24～72h。

进一步的，所述的静置的时间为20～40min。

进一步的，所述待转染细胞为hela细胞，而不仅限于hela细胞。

所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在细胞成像方面的应用，例如，可应用于待观察物质进出细胞的成像中，例如，待观察物质的内吞过程、排出过程等，所述的待观察物质可以是所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料，或质粒dna负载于所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料后形成的物质。

其中，待观察物质的内吞过程成像及定量检测的具体方法包括以下步骤：

将接种有细胞密度为20％～30％的细胞培养24h后，用dmem洗涤两次后，加入待观察物质，在无血清培养基中培养不同的时间后，观察待观察物质在细胞内的成像情况，或检测细胞内吞待观察物质的含量变化情况。

其中，所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料的排出过程成像及定量检测的具体方法包括以下步骤：

将接种有细胞密度为20％～30％的细胞培养24h后，用dmem洗涤两次后，加入所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料，在无血清培养基中培养12h后，用dmem洗涤两次，再培养不同的时间后，检测细胞排出待观察材料含量变化情况。

进一步的，所述近红外发光的多肽自组装金纳米材料使用的浓度为20nm～80nm，细胞内吞观察时间为0～24h，细胞排出观察时间为0～48h，细胞成像环境为无酚红的rpmi1640培养基。

进一步的，所述多肽自组装金纳米材料发射波长范围为600～850nm，激发波长范围为300～550nm，细胞成像过程观察使用共聚焦成像系统，待观察材料进出细胞含量变化情况可使用电感耦合等离子体质谱仪进行检测。

本发明以自组装多肽为模板合成金纳米发光材料，在金纳米粒子具有生物相容性好，毒性小，光学性能优良的基础上，通过本发明设计的环肽上带正电的精氨酸与带负电的质粒dna结合，成功实现了纳米材料对质粒dna的负载。多肽成环部分在设计中以d型与l型交替的氨基酸通过肽键首尾相连形成的一种近似平面的环状构象，其自组装主要是以环肽分子骨架上的c＝o和n-h形成分子之间的氢键网络，然后再通过β-片层反平行方式堆积形成的一种中空纤维状结构；其中三个精氨酸使得材料更好的进入细胞和与质粒dna结合，而旁边支链通过半胱氨酸提供巯基用于接金纳米来增加其发光性能。本发明以具有低细胞毒性及高负载效率的组装材料为模板来合成发光的金纳米材料，为基因诊断与治疗领域的进一步发展提供了一种新的途径。

图1依次展示了本发明的环肽本身的结构，自组装原因，所述环肽自组装后形成的形貌和以所述的环肽自组装结构为模板与氯金酸、还原剂(以谷胱甘肽为例)反应后所形成结构。

本发明合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料生物相容性好，毒性低，在质粒转染方面，具有良好的效果，可以成为化学转染的另一种途径；而此近红外发光多肽自组装金纳米材料在dpbs、rpmi1640培养基、nacl等条件下荧光稳定性好，量子效率高，用共聚焦显微镜可以明显的观察到材料进出细胞的情况，故此近红外发光多肽自组装金纳米材料在细胞成像、活体示踪等领域具有较大的应用前景。

本发明实现了多肽载体的可视化研究，可用于生物传感、医学诊断及荧光成像等领域研究，具有灵敏度高、重复性好和操作简便等特点；同时，由于引入了具有超小的尺寸和独特的光学性质纳米金材料，也可通过电感耦合等离子体质谱仪来定量，在疾病研究、肿瘤靶向及细胞成像等领域具有良好的应用前景。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料，合成工艺简单，成本低，易于工业化生产。

(2)本发明合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料生物相容性好，毒性低，转染过程简单，转染效果较好且纳米材料能排出细胞。

(3)本发明合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料具有近红外发光特点，量子效率高，稳定性好，激发波长范围广，可以很好的用于细胞成像，具有可视化示踪功能(例如，通过共聚焦显微镜观察)，用于研究细胞成像及转染途径，操作简单。

附图说明

图1为本发明的近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备流程示意图。

图2为实施例1中多肽自组装后所形成的环肽自组装结构的原子力显微镜图，其中，a为多肽自组装的原子力显微镜图，b为高度图。

图3为实施例1中合成的产物的荧光激发光谱，荧光发射光谱以及紫外吸收光谱图。

图4为实施例1中合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料的x射线光电子能谱图。

图5为实施例1中合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料的透射电子显微镜图。

图6为实施例1中合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料的单颗金纳米粒子的粒径统计图。

图7为实施例1中合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料在dpbs条件下荧光稳定性图。

图8为实施例1中合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料在rpmi1640培养基条件下荧光稳定性图。

图9为实施例1中合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料在不同nacl浓度下荧光稳定性图。

图10为实施例2中近红外发光多肽自组装金纳米材料的荧光激发光谱，荧光发射光谱图。

图11为实施例3中近红外发光多肽自组装金纳米材料的荧光发射光谱图。

图12为实施例4中近红外发光多肽自组装金纳米材料在不同浓度下的毒性实验结果分析图。

图13为实施例4中近红外发光多肽自组装金纳米材料负载质粒pmscv-puro-gfp转染hela细胞的荧光成像图。

图14为实施案例5中为聚乙烯亚胺在不同浓度下的毒性实验结果分析图。

图15为实施案例5中近红外发光多肽自组装金纳米材料负载质粒pcdna3.1(+)-ires-gfp-p53转染hela细胞的荧光成像图。

图16为实施案例5中近红外发光多肽自组装金纳米材料负载质粒pcdna3.1(+)-ires-gfp-p53转染hela细胞的效率统计图。

图17为实施例6中hela细胞对近红外发光多肽自组装金纳米材料在不同时间下内吞情况的定量分析图。

图18为实施例6中近红外发光多肽自组装金纳米材料不同时间下在hela细胞中荧光成像图。

图19为实施例7中近红外发光多肽自组装金纳米材料在不同时间下排出细胞的结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

在以下具体实施例中，所涉及的到的hela细胞购自atcc，质粒pmscv-puro-gfp可购于深圳市伟通生物科技有限公司，质粒pcdna3.1(+)-ires-gfp-p53委托山东维真生物科技有限公司构建，无血清dmem培养基(gibico，货号：lot8118192)，胎牛血清(lonsasciencesrl，cas号：s711-001s)。观察近红外发光多肽自组装金纳米材料发光性质及其在细胞转染与细胞成像分析等方面的仪器主要包含苏州fsm-precision公司原子力显微镜(fsm-nanoview1000)、日本电子株式会社jem-2100f透射电子显微镜、美国perkinelmer荧光/磷光/发光光度计(ls-55)、奥林巴斯共聚焦荧光成像系统以及德国thermoscientific电感耦合等离子体质谱仪(icaprq)等。

实施例1

设计如式ⅰ所示的多肽c(arararad)-acp-c，委托合肥国肽生物科技有限公司进行合成。

在室温条件下，将84μl氯金酸(73mm)、272μlnaoh(0.1m)和1336.8μl水加入5mlep管中，随后加入51.2μl所述的多肽(6mm)，室温静置30min后，加入256μlph为中性的谷胱甘肽(24mm)，室温下静置1小时，随后于95℃油浴锅中磁力搅拌反应12h，磁力搅拌转速为1500rpm，溶液由浅黄色到无色透明最后到棕黄色，停止反应，用透析袋在ph为中性的水中透析2天去除多余的小分子，最后用10kda的超滤管超滤浓缩透析液，得到目标产物，放入4℃冰箱储存备用。

考察本实施例制得的近红外发光多肽自组装金纳米材料的荧光在不同溶剂中的稳定性：

(1)在dpbs或rpmi1640培养基条件下的荧光稳定性研究

取30μl所述的合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料，分别加入dpbs或rpmi1640培养基稀释至1ml，用荧光发光光度计检测在不同时间点的荧光。

(2)在不同浓度nacl溶液中的荧光稳定性研究

分别取30μl所述的合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料，加入不同体积的1mnacl溶液，再加水稀释至1ml，用荧光发光光度计检测在不同浓度nacl对多肽自组装金纳米材料荧光光谱的影响。

图1为近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备流程示意图。

图2中a为所述的环肽自组装结构的原子力显微镜图，b为高度图，如图所示其形状为纤维状，长度为200～600nm，高度为0.6nm。

图3为本实施例所制得的近红外发光多肽自组装金纳米材料的荧光激发光谱，荧光发射光谱以及紫外吸收光谱，在810nm处有最大发射峰。

合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料的x射线光电子能谱图，au(0)含量比au(i)要少，如图4。

合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料的透射电子显微镜图，如图5所示，所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料为组装体，其组装形貌为条形，而条形上每个黑色颗粒表示为在多肽自组装体上生长的金纳米颗粒。

通过粒径分析软件(如nanomeasurer1.2.5)对合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料的单颗金纳米粒子进行统计，结果如图6所示，其粒径为1.5～2.5nm。

图7表示合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料在dpbs条件下荧光稳定性好。

图8表示合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料在rpmi1640培养基条件下荧光稳定性好。

图9表示为合成的近红外发光多肽自组装金纳米材料在不同nacl浓度下荧光较稳定。

实施例2

在室温条件下，将84μl氯金酸(73mm)、272μlnaoh(0.1m)和1336.8μl水加入5mlep管中，随后加入51.2μl多肽(同实施例1)，室温静置40min后，加入256μlph为中性的谷胱甘肽(24mm)，室温下静置1小时，随后于90℃油浴锅中磁力搅拌反应30h，磁力搅拌转速为1500rpm，溶液由浅黄色到无色透明最后到棕黄色，停止反应，用透析袋在ph为中性的水中透析2天去除多余的小分子，最后用10kda的超滤管超滤浓缩透析液，得到目标产物，放入4℃冰箱储存备用。

图10为近红外发光多肽自组装金纳米材料的荧光激发光谱和荧光发射光谱，在810nm处有最大发射峰。

实施例3

在室温条件下，将21μl氯金酸(73mm)、68μlnaoh(0.1m)和341.88μl水加入2mlep管中，随后加入5.12μl多肽(同实施例1)，室温静置30min后，加入64μlph为中性的谷胱甘肽(24mm)，室温下静置1小时，随后于95℃油浴锅中磁力搅拌反应8h，磁力搅拌转速为1500rpm，溶液由浅黄色到无色透明最后到棕黄色，停止反应，用透析袋在ph为中性的水中透析2天去除多余的小分子，最后用10kda的超滤管超滤浓缩透析液，得到目标产物，放入4℃冰箱储存备用。

图11为近红外发光多肽自组装金纳米材料的荧光发射光谱图，在810nm处有最大发射峰。

实施例4

本发明制备近红外发光多肽自组装金纳米材料用于负载质粒转染hela细胞的实施方案如下(实验组)：将16μl实施例1制备的纳米材料(2.15μm)、2μg质粒pmscv-puro-gfp和82μl无血清dmem培养基混合，涡旋1～2min后静置半小时，将混合物加入40％～60％的细胞密度的共聚焦培养皿中，加入700μl无血清dmem培养基培养12h后，吸走培养液，改用1ml含10％胎牛血清的dmem培养基培养，培养24h后用dpbs洗涤2次，最后加入无酚红的rpmi1640用共聚焦显微镜观察细胞荧光蛋白的表达情况。

通过cck8检测试剂盒对近红外发光多肽自组装金纳米材料进行不同浓度下的毒性实验研究。

图12为近红外发光多肽自组装金纳米材料在不同浓度下的毒性实验，如图所示材料基本无毒。

图13为近红外发光多肽自组装金纳米材料负载质粒pmscv-puro-gfp转染hela细胞的荧光成像图，其中，空白组的细胞培养皿中未加质粒和材料，其他条件与实验组一样；质粒组的细胞培养皿中，未加纳米材料，其他条件与实验组一样；对照组的细胞培养皿中，添加材料为谷胱甘肽合成的金纳米材料(该金纳米材料的制备方法除了不加入如式ⅰ所示的多肽外，其他操作与实施例1相同)，其他条件与实验组一样；如图所示近红外发光多肽自组装金纳米材料的实验组展现了很好的转染效果。

实施例5

本发明制备近红外发光多肽自组装金纳米材料用于负载质粒转染hela细胞的另一实施方案如下(实验组，发光多肽自组装金纳米材料+质粒)：将16μl实施例1制备的纳米材料(2.15μm)、2μg质粒pcdna3.1(+)-ires-gfp-p53和82μlopti-dmem培养基混合，涡旋1～2min后静置半小时，将混合物加入40％～60％的细胞密度的共聚焦培养皿中，加入700μl无血清opti-dmem培养基混合12h后，吸走培养液，改用1ml含10％胎牛血清的dmem培养基培养，培养24h后用dpbs洗涤2次，最后加入无酚红的rpmi1640用共聚焦显微镜观察细胞荧光蛋白的表达情况。

以hela细胞为受试细胞，通过cck8检测试剂盒对阳离子聚合物聚乙烯亚胺(pei)进行不同浓度下的毒性实验研究。

图14为聚乙烯亚胺在不同浓度下的毒性实验，如图所示聚乙烯亚胺随着浓度的增加毒性加大。

图15为近红外发光多肽自组装金纳米材料负载质粒pcdna3.1(+)-ires-gfp-p53转染hela细胞的荧光成像图，其中，质粒组的细胞培养皿中，未加近红外发光多肽自组装金纳米材料，其他条件与实验组一样；对照组的细胞培养皿中，添加材料为谷胱甘肽合成的金纳米材料(该金纳米材料的制备方法除了不加入如式ⅰ所示的多肽外，其他操作与实施例1相同)；其他条件与实验组一样；多肽组的细胞培养皿中，添加材料为多肽自组装材料，其他与实验组一样；聚乙烯亚胺组的细胞培养皿中，添加材料为聚乙烯亚胺，其他与实验组一样。如图所示近红外发光多肽自组装金纳米材料的实验组与其他组对比展现了很好的转染效果。

图16为近红外发光多肽自组装金纳米材料负载质粒pcdna3.1(+)-ires-gfp-p53转染hela细胞的效率统计图，如图所示近红外发光多肽自组装金纳米材料的实验组与其他组对比展现了很好的转染效果。

实施例6

本发明制备近红外发光多肽自组装金纳米材料用于研究组装材料进入细胞的具体实施方案如下：将接种有细胞密度为20％～30％共聚焦培养皿的细胞培养24h后，用dmem洗涤两次后，加入10μl实施例1制备的纳米材料(2.15μm)，在1ml无血清dmem培养基中培养，用共聚焦显微镜观察材料在不同的时间内(2h、8h、12h、24h)细胞内吞成像情况。

图17为近红外发光多肽自组装金纳米材料在不同时间下内吞情况的定量分析。

图18为近红外发光多肽自组装金纳米材料不同时间下在hela细胞中成像情况，如图所示，在0～24h内吞量随着时间的增长而增多。

实施例7

本发明制备近红外发光多肽自组装金纳米材料用于研究组装材料排出细胞的具体实施方案如下：将接种有细胞密度为20％～30％12孔板的hela细胞培养24h后，用dmem洗涤两次后，加入15μl实施例1制备的纳米材料(2.15μm)，在无血清dmem培养基中培养12h后，用含10％血清的dmem培养基培养不同的时间(4h、8h、12h、48h)，最后收集细胞及不同时间下的培养液，用王水消解，用电感耦合等离子体质谱仪定量细胞内与培养液中金的含量来研究细胞的排出情况。

图19为近红外发光多肽自组装金纳米材料在不同时间下排出细胞的情况。结果如图所示，在48h后，有接近40％的材料排出细胞。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南理工大学

<120>近红外发光多肽自组装金纳米材料及其制备方法与应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>所述多肽为环肽，环肽上的天冬氨酸羧基的连接6-氨基己酸（acp），其末端再接半胱氨酸

<400>1

alaargalaargalaargalaasp

15