一种“开关”型CQDs@Ag核壳纳米荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及荧光探针技术领域，特别涉及一种“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

超氧阴离子(o2^·-)是细胞内氧气发生单电子还原反应产生的活性氧自由基(ros)产物，是所有其他氧自由基的前身。正常情况下，生物体内o2^·-的产生与清除保持相对平衡，维持在极低的水平，且参与氧化还原信号途径，进而调控细胞增殖、分化及自噬等。o2^·-过量时会产生氧化损伤，导致体内脂质过氧化，并引发机体衰老、自噬等相关疾病的产生。因此，开发高灵敏、高选择性、操作简便的o2^·-检测方法，对o2^·-的浓度变化进行动态监测，对剖析相关生理过程和疾病发展的分子机制具有重要意义。

对于细胞内o2^·-的检测，陈等人通过化学手段合成金银纳米核壳探针，但是这种方法涉及暗场显微镜上等离子散射光谱的搭建、微流控系统的构建等复杂操作，难以在普通实验室大范围推广；马等人采用化学氧化还原合成碳量子点和银复合纳米材料，但该复合纳米材料的银层厚度不可控，无法被细胞内痕量o2^·-完全刻蚀，使得荧光释放，因此无法有效响应细胞内的o2^·-。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明目的在于提供一种“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针及其制备方法和应用。本发明提供的“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针能实现对细胞内超氧阴离子的可视化实时荧光检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针，所述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针具有核壳结构，其内核为荧光碳量子点，壳层为银纳米壳层；所述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的粒径为15～20nm。本发明提供了一种“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针，具有核壳结构，其内核为荧光碳量子点，壳层为银纳米壳层；所述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的粒径为15～20nm。

优选的，所述荧光碳量子点为富含羧基和羟基官能团的水溶性碳量子点。

优选的，所述荧光碳量子点的粒径为3～6nm。

本发明提供了上述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将荧光碳量子点水溶液与nabh4、agno3混合，进行包覆反应，得到包覆反应溶液；所述荧光碳量子点、nabh4和agno3的质量比为0.4～1.0：0.4～1.6：1.7～6.8；

(2)将所述包覆反应溶液依次进行离心和透析，得到“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针。

优选的，所述步骤(1)中荧光碳量子点水溶液的质量浓度为0.4～1mg/ml。

优选的，所述步骤(1)中包覆反应的温度为30～40℃，时间为10～30min。

优选的，所述步骤(2)中离心的转速为6000～10000rpm，时间为10min；所述透析的时间为24～48h。

本发明提供了上述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针在检测细胞内超氧阴离子中的应用。

优选的，所述应用的方法包括以下步骤：

(1)将“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针与pbs缓冲液混合，得到“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针缓冲溶液；

(2)饥饿诱导细胞自噬，并将“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针溶液与饥饿诱导后的细胞进行共孵育；

(3)观察细胞内荧光变化情况。

本发明通过对纳米荧光探针的粒径进行控制，银纳米壳层能够将碳量子点核的荧光有效猝灭，用于检测细胞内超氧阴离子时，自噬诱导后的细胞会产生高于正常细胞浓度的o2^·-，可以将银纳米壳层有效刻蚀，使得碳量子点的荧光重新释放，从而实现对细胞内超氧阴离子的可视化实时荧光检测。

本发明提供了上述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的制备方法，此法通过对原料的用量比例进行限定，能够实现对银纳米壳层厚度的可控合成。同时，此法操作简单，原料来源广泛，易于实现工业化生产。

附图说明

图1是实施例1所得cqds的高分辨透射电镜图；

图2是实施例1所得“开关”cqds@ag核壳纳米荧光探针的高分辨透射电镜图；

图3是实施例1所得“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的afm表征图；

图4是实施例1所得“开关”cqds的紫外吸收光谱图；

图5是实施例1所得“开关”cqds@ag核壳纳米荧光探针的紫外吸收光谱图；

图6是实施例1所得cqds和“开关”cqds@ag核壳纳米荧光探针的荧光光谱图；

图7是实施例1所得cqds和“开关”cqds@ag核壳纳米荧光探针的zeta电位图；

图8是实施例1～6所得“开关”cqds@ag核壳纳米荧光探针的afm图；

图9是cqds和“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针在mcf-7细胞内的荧光成像图；

图10是“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针在mcf-7细胞内的实时荧光成像图。

具体实施方式

本发明提供了一种“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针，所述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针具有核壳结构，其内核为荧光碳量子点，壳层为银纳米壳层；所述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的粒径为15～20nm。在本发明中，所述荧光碳量子点的粒径为优选为3～6nm，更优选为4～6nm。

在本发明中，所述荧光碳量子点优选为富含羧基和羟基官能团的水溶性碳量子点。本发明对所述荧光碳量子点的来源没有特殊的要求，使用本领域市售的荧光碳量子点或自行制备荧光碳量子点均可。当自行制备荧光碳量子点时，制备方法优选包括以下步骤：

(1)将柠檬酸、尿素与水混合，进行超声处理，得到混合溶液；

(2)将所述混合溶液进行水热反应，之后依次进行离心、透析、冷冻和干燥，得到荧光碳量子点。

本发明优选将柠檬酸、尿素与水混合，进行超声处理，得到混合溶液。在本发明中，所述柠檬酸、尿素与水的质量比优选为1～3:0.5:25，更优选为1:0.5:2.5。本发明对所述混合的具体方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合。在本发明中，所述超声处理的功率优选为60khz，时间优选为20～30min，更优选为25min。

得到混合溶液后，本发明优选将所述混合溶液进行水热反应，之后依次进行离心、透析、冷冻和干燥，得到荧光碳量子点。在本发明中，所述水热反应的温度优选为160～200℃，更优选为180℃；时间优选为8～10h，更优选为9h；本发明优选在含有聚四氟衬里的反应釜中进行水热反应。在本发明中，所述离心的转速优选为10000rpm，时间优选为10min；所述透析的时间优选为2～3天；本发明对所述透析的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的透析方式即可。在本发明中，所述冷冻的温度优选为-80℃，时间优选为2h；在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥，所述干燥的温度优选为-80℃，时间优选为24h。

得到荧光碳量子点后，本发明还优选将所述荧光碳量子点配制成水分散液进行保存。在本发明中，所述水分散液的浓度优选为8mg/ml；所述保存的温度优选为-4℃。

本发明提供的“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的粒径为15～20nm，优选为16～18nm，所述纳米荧光探针的形状为球形，其大小均一，稳定性好。本发明通过对纳米荧光探针的粒径进行控制，银纳米壳层能够将碳量子点核的荧光有效猝灭，用于检测细胞内超氧阴离子时，自噬诱导后的细胞会产生高于正常细胞浓度的o2^·-，可以将银纳米壳层有效刻蚀，使得碳量子点的荧光重新释放，从而实现对细胞内超氧阴离子的可视化实时荧光检测。

本发明提供了上述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将荧光碳量子点水溶液与nabh4、agno3混合，进行包覆反应，得到包覆反应溶液；

(2)将所述包覆反应溶液依次进行离心和透析，得到“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针。

本发明将荧光碳量子点水溶液与nabh4、agno3混合，进行包覆反应，得到包覆反应溶液。在本发明中，所述荧光碳量子点水溶液的质量浓度优选为0.4～1mg/ml，更优选为0.8mg/ml；所述agno3优选以水溶液的形式加入，所述agno3溶液的质量浓度优选为0.34mg/ml。在本发明中，所述荧光碳量子点、nabh4和agno3的质量比为0.4～1.0：0.4～1.6：1.7～6.8，优选为0.8：0.8：3.4；本发明通过对原料的用量比例进行限定，控制银层的厚度，进而将“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的粒径控制在15～20nm。

本发明优选先将nabh4加入到荧光碳量子点水溶液中进行搅拌，搅拌后再加入agno3溶液；所述搅拌的温度优选为30～40℃，更优选为35℃，时间优选为5min。在本发明中，nabh4溶于水后会产生微量的naoh，能够调节体系的酸碱性，使得环境ph在7～8之间，有利于包覆反应的进行。

在本发明中，所述包覆反应的温度优选为30～40℃，更优选为35℃，时间优选为10～30min，更优选为15～25℃；所述包覆反应时的搅拌速率优选为500～1000rpm，更优选为600～800rpm。在包覆反应过程中，碳量子点作为核结构，ag⁺与碳量子点表面的羧基和羟基等基团通过静电结合附着在碳量子点表面，强还原性的nabh4将碳量子点表面的ag⁺还原成小的银纳米颗粒，银纳米颗粒在搅拌时不断生长，形成致密的银纳米层。

得到包覆反应溶液后，本发明将所述包覆反应溶液依次进行离心和透析，得到“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针。在本发明中，所述离心的转速优选为6000～10000rpm，更优选为7000～9000rpm，时间优选为10min；在本发明中，所述透析的时间优选为24～48h，更优选为30～45h。本发明通过离心和透析去除包覆反应溶液中的杂质。

本发明通过对原料的用量比例进行限定，能够实现对银纳米壳层厚度的可控合成。同时，本发明提供的制备方法操作简单，原料来源广泛，易于实现工业化生产。

本发明还提供了上述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针在检测细胞内超氧阴离子中的应用。本发明通过对银纳米壳层厚度进行可控合成，能够将碳量子点核的荧光有效猝灭，用于检测细胞内超氧阴离子时，自噬诱导后的细胞会产生高于正常细胞浓度的o2^·-，可以将银壳有效刻蚀，使得碳量子点的荧光重新释放，从而实现对细胞内超氧阴离子的可视化实时荧光检测。在本发明中，所述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针能够用于制备检测细胞内超氧阴离子的药物。

在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：

(1)将“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针与pbs缓冲液混合，得到“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针缓冲溶液；

(2)饥饿诱导细胞自噬，并将“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针溶液与饥饿诱导后的细胞进行共孵育；

(3)观察细胞内荧光变化情况。

本发明优选将“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针与pbs缓冲液混合，得到“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针缓冲溶液。在本发明中，所述“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针缓冲溶液的质量浓度优选为100～500μg/ml，更优选为200～400μg/ml。在本发明中，pbs缓冲液类似于细胞正常生长的生理环境，cqds@ag核壳纳米荧光探针与pbs缓冲液混合，可以保持其ph值适合细胞生长，并保持其与ebss平衡液浓度变化的一致性。

得到“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针缓冲溶液后，本发明优选饥饿诱导细胞自噬，并将“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针溶液与饥饿诱导后的细胞进行共孵育。本发明优选使用earle's平衡盐溶液(ebss)饥饿诱导细胞自噬，所述用earle's平衡盐溶液的用量优选为200μl，所述饥饿诱导的时间优选为30min。在本发明中，所述共孵育的温度优选为37℃，时间优选为30～90min；本发明优选在含5％co2的培养箱中进行共孵育。

共孵育完成后，本发明优选观察观察细胞内荧光变化情况。本发明优选在365nm激发光波长下，使用荧光显微镜观察细胞内荧光变化情况，荧光强度越大，出现荧光的范围越大说明细胞中超氧离子的含量越多。

下面结合实施例对本发明提供的“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

准确称取1g柠檬酸和0.5g尿素，溶于25ml的超纯水中，超声处理30min，超声后放置于含有聚四氟衬里的反应釜中，在高温反应炉中180℃下反应8h。得到黄褐色浑浊液；将浑浊液取出在10000rpm转速下进行离心10min，得到黄色透明上清液。将上清液透析48h，取出后在-80℃冰箱中预冻存2h，采用冷冻干燥机进行冷冻干燥24h，得到荧光碳量子点(cqds)粉末，将cqds粉末配制成8mg/ml的cqds水分散溶液，置于-4℃的冰箱中备用。

将8mg/ml的cqds水溶液稀释成0.8mg/ml的分散溶液，取出1ml0.8mg/ml的分散溶液，加入0.8mg的nabh4固体，加超纯水定容至10ml，并搅拌分散，在40℃中水浴5min；将3.4mg的agno3固体溶于10ml超纯水中，放入50ml的滴液漏斗中，缓慢滴加至碳量子点与nabh4混合液中，在水浴锅中40℃中搅拌进行包覆反应30min，反应结束后取出包覆反应溶液，冷却至常温，将制备好的溶液10000rpm离心10min，并透析48h，除去溶液中杂质，得到“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针。

对所得cqds和“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针进行高分辨透射电镜(tem)分析，所得结果分别为图1和图2。由图1和图2可知，cqds和“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针均为球状，cqds的粒径分布在2～6nm，“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的尺径为15nm左右。

对所得“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针进行原子力显微镜(afm)表征，所得结果如图3所示，由图3可知，本发明所得“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针在afm中的高度分布在15nm左右，与图2所得tem分析结果相对应。

对所得cqds和“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针进行紫外吸收光谱分析，所得紫外吸收光谱图分别为图4和图5。由图4可以看出，在232nm的特征吸收峰属于sp²杂化的c＝c双键，310nm出的肩峰主要归因于c＝o或者c＝n的吸收峰，说明碳量子点已经形成；由图5可以看出，在238nm处出现了属于碳量子点的吸收峰，408nm处的吸收峰代表银纳米的形成，因此可以说明“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的形成。

对所得cqds和“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针进行荧光光谱分析，所得荧光光谱图为图6。由图6可知，碳量子点在360nm波长激发下，其表现为强的荧光，而“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针几乎没有荧光，说明经银纳米颗粒包覆后，碳量子点核的荧光发生了猝灭。

对所得cqds和“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针进行zeta电位分析，所得zeta电位图如图7所示。由图7可以看出，由于碳量子点表面富含羧基和羟基，其电性表现为负电性，且由于大量羧基和羟基官能团的存在，对应的zeta电位绝对值大，表现为碳量子点溶液稳定性好；而“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的电位值较小，电性表现为相对稳定，主要是其表面银层的不稳定性，应用于细胞检测中易于刻蚀。

实施例2

在实施例1的基础上，只改变agno3固体加量为1.7mg，其余合成过程同实施例1，合成“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针。对所得“开关”型cqds@ag纳米核壳探针分别进行高分辨透射电镜(tem)分析、紫外吸收光谱图分析、荧光光谱分析、zeta电位分析，所得结果与实施例1“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的结果相似。

实施例3

在实施例1基础上，只改变agno3固体加量为6.8mg，其余合成过程同实施例1，合成“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针。对所得“开关”型cqds@ag纳米核壳探针分别进行高分辨透射电镜(tem)分析、紫外吸收光谱图分析、荧光光谱分析、zeta电位分析，所得结果与实施例1“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的结果相似。

实施例4

在实施例1基础上，只改变nabh4固体加量为1.6mg，其余合成过程同实施例1，合成“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针。对所得“开关”型cqds@ag纳米核壳探针分别进行高分辨透射电镜(tem)分析、紫外吸收光谱图分析、荧光光谱分析、zeta电位分析，所得结果与实施例1“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的结果相似。

实施例5

在实施例1基础上，只改变nabh4固体加量为2.4mg，其余合成过程同实施例1，合成“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针。对所得“开关”型cqds@ag纳米核壳探针分别进行高分辨透射电镜(tem)分析、紫外吸收光谱图分析、荧光光谱分析、zeta电位分析，所得结果与实施例1“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的结果相似。

实施例6

在实施例1基础上，只改变nabh4固体加量为0.4mg，其余合成过程同实施例1，合成“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针。对所得“开关”型cqds@ag纳米核壳探针分别进行高分辨透射电镜(tem)分析、紫外吸收光谱图分析、荧光光谱分析、zeta电位分析，所得结果与实施例1“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的结果相似。

对实施例1～6的“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针分别进行afm表征，所得结果为图8所示，其中a为实施例1所得“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的afm表征图，b为实施例2所得“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的afm表征图，c为实施例3所得“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的afm表征图，d为实施例4所得“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的afm表征图，e为实施例5所得“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的afm表征图，f为实施例6所得“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的afm表征图。

基于afm表征中“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针高度分布可以看出，本发明制备方法能够有效地将“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的粒径控制在15～20nm范围内，而cqds的尺径分布在2～6nm，因此本发明方法能够实现对银纳米壳层厚度的可控合成。

实施例7

将mcf-7细胞(人乳腺癌细胞)孵育在已放置爬片的24孔板中，在恒温培养箱中生长24h，待细胞均匀生长在爬片上，采用含10％胎牛血清的新鲜配制的1640培养基(含双抗)孵育30min，然后cqds和实施例1所得“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针分别进行孵育，孵育不同时间，将爬片经过pbs缓冲液进行清洗，清洗三次，并采用4％多聚甲醛固定。

为研究自噬过程中o2^·-的可视化检测，首先采用earle's平衡盐溶液诱导mcf-7细胞发生自噬，采用200μl的earle's平衡盐溶液诱导mcf-7细胞30min，然后加入10μl“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针，使“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针与mcf-7细胞在37℃含5％co2的培养箱中进行共孵育。

使用莱卡荧光显微镜分别观察cqds和“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针与正常mcf-7细胞共孵育后的细胞成像，以及“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针与饥饿诱导后的mcf-7细胞共孵育后的细胞成像，成像结果如图9所示。

由图9可以看出，碳量子点在正常培养细胞中具有荧光信号，而“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针，在正常培养细胞中没有无荧光信号，这就说明，细胞本底o2^·-无法刻蚀“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的银纳米壳层，碳量子点荧光被猝灭。“开关”型cqds@ag纳米核壳探针与饥饿诱导后的mcf-7细胞共孵育后，细胞显示蓝色荧光信号，这就说明，饥饿诱导细胞自噬产生o2^·-后，“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针的银纳米壳层被刻蚀，使得碳量子点的荧光重新释放，从而实现对细胞内超氧阴离子的可视化荧光检测。

以“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针与正常mcf-7细胞共孵育作为对照，分别孵育不同时间，在365nm激发光波长激发下，使用莱卡荧光显微镜分别观察不同孵育时间下“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针与正常mcf-7细胞共孵育后的细胞成像以及“开关”型cqds@ag核壳纳米荧光探针与饥饿诱导后的mcf-7细胞共孵育后的细胞成像，成像结果如图10所示。由图10可以看出，随着自噬进程的发展，细胞的蓝色荧光信号逐渐增强。因此，本发明通过对银纳米壳层厚度进行可控设计，可有效响应细胞自噬不同进程o2^·-的浓度变化，实现细胞内o2^·-的实时荧光检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。