一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针及制备方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针及其制备方法。

背景技术：

胶原蛋白作为哺乳动物体内含量最多的蛋白质，是细胞外基质的主要组成成分，在组织形成和维持体内平衡中发挥关键作用。人体的正常发育和组织修复中存在胶原重塑的过程，即天然胶原的三螺旋结构在蛋白水解酶或其他外力的作用下会发生形变或降解，若在胶原重塑过程中，胶原产生过多，则过量的胶原会在器官中累积，容易产生组织纤维化，最终导致肿瘤等严重疾病；若胶原发生不可控的降解，则会导致胶原蛋白退化性疾病，如关节炎等。因此，如何快速准确的检测机体组织中的病变胶原蛋白的含量，对于预防和治疗胶原蛋白病变相关的疾病具有重要意义。

靶向识别技术是实现肿瘤等疾病的早期检测和精确诊断的关键技术，在生物医学领域应用广泛。而胶原蛋白同时参与调控细胞的增殖、分化和迁移等基本生命活动，并与成骨不全症、关节炎、肿瘤等重大疾病息息相关，可作为人体众多疾病的关键生物标记物。因此，实现对胶原蛋白的靶向检测对这些疾病的早期诊断和治疗至关重要。

目前，对于机体组织中的病变胶原蛋白含量的检测主要通过抗体抗原免疫法或传统染料为核心的试剂盒来检测，包括he染色法、v.g染色法和masson染色法等。这些方法可以实现胶原纤维染色，但是，它们通常步骤复杂，染色过程会对组织造成破坏，染色之后的组织不易用于其它染色。并且，这些方法会检测所有的胶原蛋白，包括正常的胶原蛋白，而不能特异性的专一检测组织中的病变胶原蛋白。随着探针技术的不断进展，目前已发现一些靶向识别胶原蛋白的多肽探针，包括天然氨基酸多肽和非天然氨基酸多肽，可用于体外胶原蛋白的识别及成像。非天然氨基酸多肽的合成成本较高，并且应用于体内检测会存在安全隐患，因此完全由天然氨基酸组成的多肽探针成为研究热点。

研究发现，由gpo(gly-pro-hyp)或gpp(gly-pro-pro)重复序列组成的天然氨基酸多肽，可特异性结合病变胶原蛋白。中国专利cn107266562a公开了一种识别病变胶原蛋白的多肽探针，该探针在gpo或gpp的重复序列上修饰荧光物质，在常温条件下容易形成三重螺旋结构；然而，三重螺旋结构会导致多肽探针丧失胶原蛋白的靶向结合能力。因此，具有三重螺旋结构的多肽探针，必须在使用前进行高温等前处理，使其保持单链状态，才能够靶向结合胶原蛋白。但是，高温等前处理过程容易导致待测组织损伤，会影响检测结果的准确性。

针对现有技术存在的问题，发明人经过多次试验研究发现，在含有多个gpo重复序列的多肽上引入数个带电荷的氨基酸，获得的新型多肽探针在生理ph环境下具有显著的单链稳定性，而在酸性条件下则形成三重螺旋结构。该多肽序列修饰信号分子后，可作为多肽探针用于病变胶原蛋白的靶向检测。与现有的胶原靶向的多肽探针相比，该ph敏感的新型多肽探针，在生理条件下，可以保持稳定的单链结构，不需要经过任何预处理，即具有特异性结合病变胶原蛋白的能力。该新型多肽探针无非天然氨基酸，制备简单，而且完全避免了预处理对组织样品的损伤风险。该新型多肽探针，可用于体外检测病变胶原蛋白的含量，在肿瘤等胶原相关疾病的早期诊断与疗效评价中具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针，该胶原多肽能够在生理ph环境下保持稳定的单链结构，不需要预处理，即可与病变胶原蛋白特异性结合。本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针，所述单链胶原多肽探针中间含有数个(gly-pro-hyp)、(gly-pro-pro)或(gly-hyp-hyp)的多肽序列，所述多肽序列上修饰功能物质；所述多肽序列的c端连有带电荷的氨基酸序列z，以促使多肽保持单链非折叠结构。

优选地，所述胶原多肽探针的序列为x-(gly-pro-hyp)a-z(a为4-20之间的整数)，x-(gly-pro-pro)a-z(a为4-20之间的整数)，x-(gly-hyp-hyp)a-z(a为4-20之间的整数)，(gly-pro-hyp)a-gly-pro-amp(-x)-(gly-pro-hyp)b-z(a和b为1-20之间的整数)、(gly-pro-pro)a-gly-pro-amp(-x)-(gly-pro-pro)b-z(a和b为1-20之间的整数)或(gly-hyp-hyp)a-gly-pro-amp(-x)-(gly-hyp-hyp)b-z(a和b为1-20之间的整数)中的一种；其中x为功能物质，gly为甘氨酸，pro为脯氨酸，hyp为羟脯氨酸，amp为4-氨基脯氨酸，z为富含带电荷氨基酸的序列。

优选地，所述功能物质x为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、bodipy类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、贵金属团簇、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料、石墨烯、氧化石墨烯、二硫化钼、二硫化钨、二氧化锰、氮化硼、碳纳米管、四氧化三铁纳米粒子、氧化铁纳米粒子、硅纳米粒子、贵金属纳米粒子、mof材料、硅球、脂质体和磁珠中的一种或几种；所述功能物质连接在胶原多肽的n端，或通过胶原多肽某一中间位置的amp(4-氨基脯氨酸)的侧链连接。

优选地，所述功能物质x为羧基荧光素fam或羧基-x罗丹明6-rox。

优选地，所述功能物质x与多肽序列通过接头ahx连接。

优选地，所述序列z包含1-15个相同或不同带电荷的氨基酸或氨基酸带电衍生物。

优选地，所述序列z包含1-6个带电荷的氨基酸。

优选地，所述带电荷的氨基酸为d。

优选地，所述单链胶原多肽探针中间含有1-15个(gly-pro-hyp)、(gly-pro-pro)或(gly-hyp-hyp)重复序列。

优选地，所述单链胶原多肽探针中间含有7个(gly-pro-hyp)。

本发明的另一目的在于提供一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a)将80-250mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8ml二氯甲烷溶胀树脂；

b)由15-25％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液脱除n端fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；

c)将n端由fmoc保护的氨基酸(4eq)与hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；

d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mldmf和dcm洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/dmf溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mldmf和dcm洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；

e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后；

f)称取功能物质(4eq)、hobt(4eq)和hbtu(4eq)，由dmf溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加diea(4-10eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；或称螯合物质(4eq)、hobt(4eq)和hbtu(4eq)，由dmf溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加diea(4-10eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；

g)树脂分别用dcm和甲醇轮流洗涤2-5次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为tfa:tis:水的质量比为95:2.5:2.5，反应1-6hrs；

h)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用tfa溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；

i)螯合物修饰肽溶解于缓冲液中，加入到缓冲液溶解的金属纳米功能物质中，肽：功能物质＝1：100，反应2-12hrs；

j)将反应液于缓冲液中透析24-48hrs。

本发明的有益效果是：①本发明提供的新型多肽探针具有ph响应特性，在酸性条件下形成三重螺旋结构，而在生理ph条件下则保持稳定的单链结构，可用于病变胶原蛋白的靶向检测；②本发明提供的新型多肽探针，不需要加热等预处理即可保持稳定的单链状态，完全避免了预处理对组织样品的损伤风险；③本发明提供的新型多肽探针不含有非天然氨基酸，制备简单；④本发明提供的新型多肽探针可用于体外检测病变胶原蛋白的含量，在肿瘤等胶原相关疾病的早期诊断与疗效评价中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1.多肽探针ph响应的热变曲线图；

图2.多肽探针溶液比色图；

图3.多肽探针f-pctp-d6对病变胶原蛋白选择性结合图；

图4.多肽探针f-pctp-d6对大鼠跟腱和尾巴组织染色图；

图5.多肽探针r-pctp-d6对大鼠皮肤组织染色图；

图6.多肽探针r-pctp-d6对肿瘤组织染色图；

图7.多肽探针r-pctp-d6对其他组织染色图；

图8.多肽探针f-pctp-(gdd)3的组织染色图；

图9.多肽探针f-pctp-(gdd)2的组织染色图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。

以下任一实施例中所述的gpo为gly(甘氨酸)-pro(脯氨酸)-hyp(羟脯氨酸)，所述的d为asp(天冬氨酸)；所述的ahx为氨基乙酸，所述的fam为羧基荧光素，所述的6-rox为6-羧基-x罗丹明。

对比例1胶原多肽探针f-pctp、f-ⁱctp的制备

1.胶原多肽探针的设计

分别设计胶原多肽的多肽序列为fam-ahx-(gpo)7-nh2、fam-ahx-lrelhlnnn-nh2。

2.胶原多肽探针的制备

(1)将100mg的rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5ml二氯甲烷溶胀树脂；

(2)由20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液脱除n端fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；

(3)将n端由fmoc保护的氨基酸(4eq)、hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs；

(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5ml的dmf和dcm洗3次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/dmf溶液处理3次，分别为5min、5min和15min；树脂再分别由5ml的dmf和dcm洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；

(5)重复步骤(3)和步骤(4)，直到合成胶原多肽序列ahx-(gpo)7和ahx-lrelhlnnn；

(6)向反应器中加入fam(10eq)和hbtu(10eq)，向溶液中滴加diea(16eq)，37℃反应20h，显色反应检测反应完全，树脂分别由5ml的dmf和dcm洗3次；

(7)树脂分别用dcm和甲醇轮流洗涤3次，将树脂抽干，加入切割液(tfa:tis:水＝95:2.5:2.5)，反应3hrs；

(8)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，离心收集沉淀，用少量tfa溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀，离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得粗肽fam-ahx-(gpo)7-nh2和fam-ahx-lrelhlnnn-nh2；粗肽由反相液相色谱纯化，得多肽探针，并分别命名为f-pctp和f-ⁱctp。

实施例1胶原多肽探针f-pctp-d1-6的制备

1.胶原多肽探针的序列设计

分别设计胶原多肽探针的多肽序列为：fam-ahx-(gpo)7-(asp)6-nh2、fam-ahx-(gpo)7-(asp)5-nh2、fam-ahx-(gpo)7-(asp)4-nh2、fam-ahx-(gpo)7-(asp)3-nh2、fam-ahx-(gpo)7-(asp)2-nh2、fam-ahx-(gpo)7-(asp)1-nh2。

2.胶原多肽探针的制备

(1)分别将100mg的rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5ml二氯甲烷溶胀树脂；

(2)由20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液脱除n端fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；

(3)将n端由fmoc保护的氨基酸(4eq)、hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs；

(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5ml的dmf和dcm洗3次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/dmf溶液处理3次，分别为5min、5min和15min；树脂再分别由5ml的dmf和dcm洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；

(5)重复步骤(3)和步骤(4)，直到合成胶原多肽ahx-(gpo)7-(asp)6、ahx-(gpo)7-(asp)5、ahx-(gpo)7-(asp)4、ahx-(gpo)7-(asp)3、ahx-(gpo)7-(asp)2和ahx-(gpo)7-(asp)1；

(6)分别向反应器中加入fam(10eq)和hbtu(10eq)，向溶液中滴加diea(16eq)，37℃反应20h，显色反应检测反应完全，树脂分别由5ml的dmf和dcm洗3次；

(7)树脂分别用dcm和甲醇轮流洗涤3次，将树脂抽干，加入切割液(tfa:tis:水＝95:2.5:2.5)，反应3hrs；

(8)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，离心收集沉淀，用少量tfa溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀，离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，即制备粗肽fam-ahx-(gpo)7-(asp)6-nh2、fam-ahx-(gpo)7-(asp)5-nh2、fam-ahx-(gpo)7-(asp)4-nh2、fam-ahx-(gpo)7-(asp)3-nh2、fam-ahx-(gpo)7-(asp)2-nh2和fam-ahx-(gpo)7-(asp)1-nh2。粗肽经过反相液相色谱纯化，即制备获得多肽探针，分别命名f-pctp-d6、f-pctp-d5、f-pctp-d4、f-pctp-d3、f-pctp-d2、f-pctp-d1。

3.胶原多肽探针的热变温度曲线测定

取对比例1制备的多肽探针f-pctp和实施例1制备的多肽探针f-pctp-d6、f-pctp-d5、f-pctp-d4、f-pctp-d3、f-pctp-d2、f-pctp-d1，并分别配置成300μm的多肽探针溶液，使用圆二色谱表征多肽探针在225nm处的强度，多肽探针溶液温度由4℃增加至75℃，升温速率为1.0℃/min，且每个温度平衡2min，测定多肽探针在不同ph条件下的热变温度曲线，根据曲线对温度做一阶导数并归一化得归一化曲线如图1所示。当ph为7.4时，随着多肽探针中d的数量增多，多肽探针的热变温度逐渐降低，说明在生理条件下，d的引入，使多肽探针保持单链的能力增强(图1a所示)。当ph为2.7时，多肽探针中d的数量对多肽探针的热变温度无影响，说明在酸性条件下，d的引入，不影响多肽探针的热变温度，多肽探针仍保持三重螺旋结构(图1b所示)。上述结果表明，d的引入使多肽探针在生理条件下，可保持稳定的单链结构，而不需要加热等预处理过程。

4.胶原多肽探针的比色实验

取多肽探针f-pctp和f-pctp-d6，并分别配置成300μm的多肽探针溶液；分别将上述各多肽探针溶液于25℃水浴恒温20min，以及0℃冰水混合物中恒温24h，由数码相机采集图片数据，观察溶液颜色。结果如图2所示，多肽探针f-pctp在0℃(图2c所示)和25℃(图2d所示)恒温处理后的颜色均为橙色，即多肽探针f-pctp在室温条件下，保持三重螺旋结构，丧失对胶原的靶向结合能力。而本发明制备的多肽探针f-pctp-d6在0℃(图2a)恒温处理后的颜色为橙色，而在室温25℃(图2b所示)下变为绿色，即多肽探针f-pctp-d6在室温条件下，可保持单链结构。上述结果表明，本发明提供的多肽探针在室温条件下能保持良好的单链稳定性，可用于胶原蛋白的靶向检测。

5.胶原多肽探针对病变胶原蛋白的靶向结合能力

分别用不同蛋白溶液(病变胶原蛋白dn-collagen)、牛血清蛋白溶液(bsa)、人血清蛋白溶液(hsa)和血红蛋白溶液(hemoglobin)包被96微孔板。取15μm的f-pctp-d6(pbs溶液)50μl分别加入到不同蛋白包被的微孔板中，室温反应5h，pbst清洗5次。酶标仪检测，并读取各酶标板荧光强度。

结果如图3所示，多肽探针f-pctp-d6对病变胶原蛋白(dn-collagen)的结合能力强，而对牛血清蛋白(bsa)、人血清蛋白(hsa)和血红蛋白(hemoglobin)基本无结合。结果表明，本发明提供的多肽探针f-pctp-d6能够特异性识别病变胶原蛋白，带电荷氨基酸的引入不影响多肽探针对病变胶原蛋白的结合能力。

6.大鼠跟腱和尾巴损伤组织染色

将损伤大鼠跟腱组织和尾巴组织制备为冰冻切片，切片至4μm的厚度，室温风干，用0.5ml封闭溶液(含5％山羊血清的pbs)处理，并在室温下孵育。用吸水纸从载玻片上除去封闭溶液；在10mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)中分别制备浓度为15μm的多肽探针f-pctp-d6和f-pctp溶液；将100μl的多肽探针溶液应用于组织切片，并在4℃下孵育2h。载玻片上的溶液被吸水纸吸收。将载玻片用10mm磷酸盐缓冲液洗涤5分钟三次。结果如图4所示，多肽探针f-pctp-d6不需要预处理，即能直接染色组织(图4a、d所示)；多肽探针f-pctp经过加热预处理后，才能染色组织(图4b、e所示)；而未经加热处理的多肽探针f-pctp不能染色组织(图4c、f所示)。结果表明，本发明提供的多肽探针f-pctp-d6不需要经过加热预处理，即可保持稳定的单链结构，可用于病变胶原蛋白的特异性检测。

实施例2胶原多肽探针r-pctp-d6的制备

1.胶原多肽探针的设计

设计的胶原多肽序列为6-rox-ahx-(gpo)7-(asp)6-nh2，其中6-rox为6-羧基-x罗丹明；2.胶原多肽探针的制备

(1)将100mg的rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5ml二氯甲烷溶胀树脂；

(2)由20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液脱除n端fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；

(3)将n端由fmoc保护的氨基酸(4eq)、hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs；

(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5ml的dmf和dcm洗3次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/dmf溶液处理3次，分别为5min、5min和15min；树脂再分别由5ml的dmf和dcm洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；

(5)重复步骤(3和步骤(4)，直到合成胶原多肽ahx-(gpo)7-(asp)6；

(6)向反应器中加入6-rox(10eq)和hbtu(10eq)，向溶液中滴加diea(16eq)，室温反应24h，显色反应检测反应完全，树脂分别由5ml的dmf和dcm洗3次；

(7)树脂分别用dcm和甲醇轮流洗涤3次，将树脂抽干，加入切割液(tfa:tis:水＝95:2.5:2.5)，反应3hrs；

(8)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，离心收集沉淀，用少量tfa溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀，离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得粗肽6-rox-ahx-(gpo)7-(asp)6-nh2；粗肽由反相液相色谱纯化，得多肽探针r-pctp-d6。

3.大鼠损伤皮肤组织特异性染色

将大鼠正常皮肤组织和烫伤模型组织制备为冰冻切片，切片至4μm的厚度，室温风干，分别用多肽探针r-pctp-d6、多肽探针f-ictp、dapi溶液、以及混合探针，于4℃染色4h，dapi染色1min，pbs洗三次，去除未结合多肽探针和过量的dapi。结果如图5所示，多肽探针r-pctp-d6仅能将烫伤模型组织中的胶原蛋白染色为橙色(图5e所示)，而对正常组织中的胶原蛋白无染色(图5a所示)；多肽探针f-ⁱctp将正常组织及烫伤组织中的i型胶原蛋白均染色为绿色(图5b、f所示)；dapi将正常组织及烫伤组织中细胞核均染色为蓝色(图5c、g所示)；叠加不同多肽探针染色部位，共染色将正常组织及烫伤组织中显示蓝色和绿色(图5d所示)，而烫伤模型组织中显示橙色、蓝色和绿色(图5h所示)。以上实验结果说明，本发明提供的多肽探针r-pctp-d6仅能结合病变组织中的胶原蛋白，而对正常组织中的胶原蛋白无结合能力。

4.肿瘤组织染色

取自兰州大学第一医院的患者的肺癌，直肠癌，乳腺癌和宫颈癌组织，用4％多聚甲醛固定1h，并包埋在石蜡中。在经聚赖氨酸处理的载玻片上将组织切成4μm的厚度。每个载玻片用二甲苯和梯度浓度乙醇脱蜡至水。然后将每个切片用0.5ml封闭溶液(含5％山羊血清的pbs)处理，并在室温下孵育。用吸水纸从载玻片上除去封闭溶液。在10mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)中制备浓度为15μm的多肽探针r-pctp-d6溶液。将100μl多肽探针r-pctp-d6溶液应用于组织切片，用石蜡膜覆盖，并在4℃下孵育2h；100μl的dapi溶液(10μg/ml)应用于组织切片1min；载玻片用10mm磷酸盐缓冲液洗涤5min，三次，将一滴抗猝灭剂添加到组织切片上，并使用盖玻片覆盖切片。将染色的组织切片在zeissaxioz2成像仪上成像。

结果如图6所示，r-pctp-d6能够将肿瘤组织中的胶原蛋白染色为橙色(图6a-d所示)；dapi溶液能够将肿瘤组织中的细胞核染色为蓝色(图6e-h所示)；叠加多肽探针r-pctp-d6和dapi溶液染色结果，肿瘤组织中的胶原蛋白染色为橙色，细胞核染色为蓝色(图6i-l所示)。说明本发明提供的多肽探针r-pctp-d6能特异性的结合肿瘤组织中的病变胶原蛋白，且不影响其他多肽探针或染料的再次染色。

5.其他组织染色

取9周龄的大鼠的肠组织、肌腱组织、尾组织、眼睛组织、耳朵组织和膀胱组织，并用1％sds脱细胞处理。将处理后的组织用4％多聚甲醛固定1小时，然后冷冻保存在tissue-teko.c.t.介质中。在载玻片上将组织切成4μm的厚度。将组织切片在-20℃下用冷甲醇渗透10min，并在20mmpbs中孵育。然后将每个切片用0.5ml封闭溶液(含5％山羊血清的pbs)处理，并在室温下孵育。用吸水纸从载玻片上除去封闭溶液。在10mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)中制备浓度为15μm的多肽探针r-pctp-d6溶液，将100μl的多肽探针r-pctp-d6溶液应用于组织切片，并在4℃下孵育2h。载玻片上的溶液被吸水纸吸收。将载玻片用10mm磷酸盐缓冲液洗涤5min，三次。将一滴抗猝灭剂添加到组织切片上，并使用盖玻片覆盖切片。使用荧光显微镜观察拍照。

结果如图7所示，本发明提供的多肽探针r-pctp-d6对肠组织(图7a所示)，肌腱组织(图7b所示)，尾组织(图7c所示)，眼睛(图7d所示)，耳朵(图7e所示)和膀胱组织(图7f所示)中的病变胶原蛋白均能染色。说明本发明提供的多肽探针r-pctp-d6对各种组织中的病变胶原蛋白均能检测，具有广谱性。

实施例3胶原多肽探针f-pctp-(gdd)3的制备

1.胶原多肽探针的设计

设计的胶原多肽序列为fam-ahx-(gpo)7-(gly-asp-asp)3-nh2，其中fam为羧基荧光素。

2.胶原多肽探针的制备

(1)将100mg的rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5ml二氯甲烷溶胀树脂；

(2)由20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液脱除n端fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；

(3)将n端由fmoc保护的氨基酸(4eq)、hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs；

(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5ml的dmf和dcm洗3次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/dmf溶液处理3次，分别为5min、5min和15min；树脂再分别由5ml的dmf和dcm洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；

(5)重复上述步骤(3)和步骤(4)，直到合成上述胶原多肽序列ahx-(gpo)7-(gly-asp-asp)3；

(6)向反应器中加入fam(10eq)和hbtu(10eq)，向溶液中滴加diea(16eq)，37℃反应20h，显色反应检测反应完全，树脂分别由5ml的dmf和dcm洗3次；

(7)树脂分别用dcm和甲醇轮流洗涤3次，将树脂抽干，加入切割液(tfa:tis:水＝95:2.5:2.5)，反应3hrs；

(8)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，离心收集沉淀，用少量tfa溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀，离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得粗肽fam-ahx-(gpo)7-(gly-asp-asp)3-nh2；粗肽由反相液相色谱纯化，得多肽探针f-pctp-(gdd)3。

3.损伤大鼠尾组织染色

在载玻片上将大鼠损伤尾组织切成4μm的厚度。将冷冻组织切片在室温下风干。pbs冲洗损伤大鼠尾组织2次，5％山羊血清封闭30min，用15μm的多肽探针f-pctp-(gdd)3，于4℃染色2h，pbs冲洗3次，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。

结果如图8所示，本发明提供的多肽探针f-pctp-(gdd)3对大鼠损伤尾巴组织中的病变胶原蛋白的结合能力强，能够将大鼠损伤尾巴组织中的病变胶原蛋白染色为绿色。本发明提供的多肽探针f-pctp-(gdd)3，可以靶向结合病变胶原蛋白，可用于不同类型组织中病变胶原蛋白的特异性检测。

实施例4胶原多肽探针f-pctp-(gdd)2的制备

1.胶原多肽探针的设计

设计的胶原多肽序列为fam-ahx-(gpo)7-(gly-asp-asp)2-nh2，其中fam为羧基荧光素。

2.胶原多肽探针的制备

(1)将100mg的rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5ml二氯甲烷溶胀树脂；

(2)由20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液脱除n端fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；

(3)将n端由fmoc保护的氨基酸(4eq)、hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs；

(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5ml的dmf和dcm洗3次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/dmf溶液处理3次，分别为5min、5min和15min；树脂再分别由5ml的dmf和dcm洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；

(5)重复上述步骤(3)和步骤(4)，直到合成上述胶原多肽序列ahx-(gpo)7-(gly-asp-asp)2；

(6)向反应器中加入fam(10eq)和hbtu(10eq)，向溶液中滴加diea(16eq)，37℃反应20h，显色反应检测反应完全，树脂分别由5ml的dmf和dcm洗3次；

(7)树脂分别用dcm和甲醇轮流洗涤3次，将树脂抽干，加入切割液(tfa:tis:水＝95:2.5:2.5)，反应3hrs；

(8)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，离心收集沉淀，用少量tfa溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀，离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得粗肽fam-ahx-(gpo)7-(gly-asp-asp)2-nh2；粗肽由反相液相色谱纯化，得多肽探针f-pctp-(gdd)2。

3.损伤大鼠尾组织染色

在载玻片上将大鼠损伤尾组织切成4μm的厚度。将冷冻组织切片在室温下风干。pbs冲洗损伤大鼠尾组织2次，5％山羊血清封闭30min，用15μm的多肽探针f-pctp-(gdd)2，于4℃染色2h，pbs冲洗3次，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。

结果如图9所示，本发明提供的多肽探针f-pctp-(gdd)2对大鼠损伤尾巴组织中的病变胶原蛋白的结合能力强，能够将大鼠损伤尾巴组织中的病变胶原蛋白染色为绿色。本发明提供的多肽探针f-pctp-(gdd)2可以靶向结合病变胶原蛋白，可用于组织中病变胶原蛋白的特异性检测。

以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。