一种从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法

本发明属于黑色素制备技术领域，涉及一种水溶性黑色素纳米粒子的制备方法，特别是涉及一种利用黑色素瘤细胞废弃培养基提取水溶性黑色素纳米粒子的方法。

背景技术：

黑色素是一种生物色素，具有多种生物功能，包括结构着色、光保护、光致敏、自由基清除、螯合金属离子、抗氧化活化和神经保护等。此外，黑色素还可以作为天然药物载体，负载抗癌药物等，在癌症诊疗一体化中发挥重要作用。

黑色素既可以通过酪氨酸及其衍生物经一系列化学反应合成得到，也可以从动物、植物或原生生物中提取得到。

从生物体中提取黑色素，是一种常见的获取黑色素的方法。可用于提取黑色素的生物体主要包括墨鱼、鱿鱼、乌骨鸡、菜粕、山杏核壳、黑萝卜、黑米等。但是，从生物体中直接提取黑色素，不仅需要进行繁琐的后处理，而且提取出来的多是微米级颗粒，还需要通过超声细胞破碎机破碎、球磨、研磨或者碱液剪切等“自上而下”或“自下而上”的方法进行处理，才能获得黑色素纳米颗粒。

然而，这样获得的黑色素纳米颗粒的水溶性仍然较差，还需要进一步通过peg等方法制备成水溶性的黑色素纳米粒子。

例如，cn109320993a公开了一种天然黑色素纳米颗粒的制备方法，是以naoh溶液对山杏核壳粉末进行超声提取，粗提液酸沉降后依次以纤维素酶和糖化酶酶解，碱溶后再次酸沉降，加热酸解后反复进行碱溶和酸沉降，得到黑色素纯品，溶于naoh溶液中，经超声处理和超声波细胞破碎机破碎，酸沉降得到黑色素纳米颗粒，最后以mpeg2000-nh2修饰处理，得到水溶性黑色素纳米颗粒。虽然该方法制备的黑色素纳米颗粒粒径均一，具有良好的水溶性和分散稳定性，但其提取过程过于繁琐，不仅需要消耗大量的溶剂，而且原料的使用量巨大。

肿瘤细胞具有无限增殖的特点。因此，从黑色素瘤细胞中提取黑色素，能够源源不断地获得黑色素产物。从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法尚未报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法，以期工艺简单、绿色、可再生地提取制备水溶性黑色素纳米粒子。

本发明所述的从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法是收集体外培养黑色素瘤细胞的细胞培养液，离心除去沉淀物，得到含有黑色素粗品的溶液，再通过膜裂解的方式对含有黑色素粗品的溶液进行处理，并纯化后，干燥得到水溶性良好的黑色素纳米粒子。

其中，所述的膜裂解的方式可以是化学裂解、酶裂解、机械裂解中的任意一种，或几种的组合。

收集到的体外培养黑色素瘤细胞的细胞培养液中主要含有死细胞碎片等杂质，通过采用低速离心的方式可以将其除去。但是，除去杂质后的上清液中仍然存在有黑色素瘤细胞分泌的囊泡、外泌体等，通过膜裂解的方式破坏囊泡膜结构，再进行纯化，清除掉除黑色素之外的其他内容物，即可获得水溶性良好的黑色素纳米粒子。

本发明所述方法中，所述的黑色素瘤细胞优选使用b16系黑色素瘤细胞，包括但不限于是b16f0、b16f10等各种鼠源黑色素瘤细胞。

进一步地，所述的细胞培养液是各种适合黑色素瘤细胞培养的基础培养基，包括但不限于是dmem高糖培养基、dmem低糖培养基、imdm培养基、prmi1640培养基等各种基础培养基。

更进一步地，本发明还在所述基础培养基中添加有必要的血清和/或抗生素，以组成完全培养基。例如，可以添加有10%fbs，以及添加1%青霉素和链霉素。

优选地，本发明使用dmem高糖培养基。在相同的培养条件下，使用dmem高糖培养基培养黑色素瘤细胞，其分泌黑色素的能力更强。

本发明所述方法中，收集黑色素瘤细胞培养液的时间应该是在细胞完全贴壁后。

更具体地，可以在铺板12～24小时后，观察培养基颜色为黑棕色时进行收集。具体可以根据黑色素瘤细胞的生长状态以及黑色素瘤细胞分泌黑色素的状态选择收集培养基的时间。

本发明所述方法中，具体是将收集的体外培养黑色素瘤细胞的细胞培养液通过低速离心的方式除去细胞碎片等杂质，并收集上清液，得到含有黑色素粗品的溶液。

更进一步地，所述低速离心的转速优选为800～1500rpm，离心时间为5～20min。

通过化学裂解可以溶解细胞或抽提胞内组分，本发明进行化学裂解所采用的化学裂解液包括但不限于是酸、碱、表面活性剂、复合配方裂解液或有机溶剂等各种常规的化学裂解液。

所述的机械裂解可以包括热休克或超声波处理。

其中，所述热休克是通过反复冷冻和解冻的方式，将含有黑色素粗品的溶液在液氮或-20℃以下进行冷冻，室温中解冻，反复几次以达到裂解细胞、破坏膜结构的效果。

所述超声波处理是采用超声波细胞破碎仪的探头处理含有黑色素粗品的溶液，利用超声空化作用将细胞破碎。

优选地，所述超声波处理的超声功率为150～1000w，超声处理时间3～120s即可。

进一步地，本发明可以采用超滤离心或透析的方法，对膜裂解处理后的溶液进行纯化处理。

具体地，所述超滤离心使用截留分子量为3～100kda的超滤膜，控制离心转速6000±2000rpm，离心时间10～30min。所述透析处理使用截留分子量在3～100kda的透析袋。

进一步地，本发明干燥得到黑色素纳米粒子的方式可以包括但不限于是冷冻干燥、鼓风干燥、真空干燥等任意一种方法。

本发明的黑色素提取方法采用了废物利用策略，利用原料——黑色素瘤细胞可以无限增殖的特点，通过简单无污染的处理方式，无需额外化学试剂，即可直接制备得到水溶性良好的小尺寸黑色素纳米粒子，是一种绿色、可再生、工艺简单的提取水溶性黑色素纳米粒子的方法。

细胞具有可以无限传代而不凋亡的特点，本发明从黑色素瘤细胞中提取水溶性黑色素纳米粒子，能够源源不断地从收集得到的废弃细胞培养液中获得黑色素产物，不仅废物利用、绿色处理，而且可以无限制备黑色素纳米粒子。

采用本发明方法制备的黑色素纳米粒子克服了现有黑色素水溶性差、粒径尺寸大的问题，不仅具有良好的水溶性，而且粒径尺寸不大于10nm，与人体具有良好的生物组织相容性，用于药物或药物载体时，对机体产生的生物毒性低，且可以通过肾脏代谢的方式排出体外，在临床、科研应用中具有广阔的应用前景和经济、社会意义。

附图说明

图1是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的溶液实物图。

图2是实施例1制备黑色素粗品的透射电子显微镜图。

图3是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图。

图4是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的高分辨透射电子显微镜图。

图5是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的粒径分布图。

图6是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的zeta电位图。

图7是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的紫外-可见光吸收光谱图。

图8是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的红外光谱图。

图9是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的细胞毒性图。

图10是实施例2制备水溶性黑色素纳米粒子的粒径分布图。

图11是实施例3制备水溶性黑色素纳米粒子的粒径分布图。

图12是实施例4制备黑色素纳米粒子粉末样品的实物图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。

除非另有指明，本发明实施例中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明实施例中涉及到的方法、工艺及设备，其名称和简称均属于本领域内常规的名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。

本发明实施例中使用的各种原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1。

体外培养鼠源黑色素细胞瘤b16f10细胞，培养液为89%dmem高糖培养基+10%fbs+1%青霉素和链霉素，于37℃、5%co2环境中培养。

待细胞培养液颜色变深(棕色、黑色或红棕色)时，取上清液于50ml离心管中，1000r/min离心5min，去除底部沉淀。重复上述步骤2～3次，直至底部无明显沉淀，得含有黑色素粗品的溶液。

使用超声波细胞破碎仪对上述黑色素粗品溶液进行超声处理，超声功率300w，超声3s间歇3s，总时长10min。

使用截留分子量为10kda的超滤离心管，将超声处理后的溶液以7000r/min超滤离心10min，并用去离子水洗涤至少3次。

将超滤离心后的所得物真空冷冻干燥，得到小尺寸的水溶性黑色素纳米粒子粉末。

图1给出了将上述制备的水溶性黑色素纳米粒子溶解在水中的实物图，显示出其良好的水溶性特性。

图2和图3分别是通过透射电子显微镜观察到的黑色素粗品和水溶性黑色素纳米粒子的形貌。其中，图2的黑色素粗品显示其背景中仍存在大量杂质，而经过本发明方法纯化后，观察到图3中黑色素纳米粒子分布均匀，背景无明显杂质。

纯化后的黑色素纳米粒子的高分辨透射电子显微镜图如图4所示。

通过马尔文粒度仪进行黑色素纳米粒子的粒径分布和电位表征，其粒径分布如图5所示，电位如图6所示，可以看出其粒径分布较窄，且尺寸在10nm以下，电位为-15.4mv。

通过紫外吸收光谱和红外光谱对黑色素纳米粒子的光学性质和结构进行表征，黑色素纳米粒子溶液的紫外吸收图谱如图7所示，红外光谱如图8所示。

采用cck-8检测方法，将不同浓度的黑色素纳米粒子与4t1细胞共孵育24h，在细胞水平验证黑色素纳米粒子的细胞毒性。图9的试验结果显示，在黑色素纳米粒子浓度高达1mg/ml的情况下，仍未显示出细胞毒性，证明本发明提取的黑色素纳米粒子是一种安全无毒的纳米粒子，安全无毒的水溶性小尺寸纳米粒子在临床医学中具有广泛的应用前景。

实施例2。

体外培养鼠源黑色素细胞瘤b16f10细胞，培养液为89%dmem高糖培养基+10%fbs+1%青霉素和链霉素，于37℃、5%co2环境中培养。

待细胞培养液颜色变深(棕色、黑色或红棕色)时，取上清液于50ml离心管中，1000r/min离心5min，去除底部沉淀。重复上述步骤2～3次，直至底部无明显沉淀，得含有黑色素粗品的溶液。

将上述黑色素粗品溶液先以ripa裂解液处理20min，再使用超声波细胞破碎仪进行超声处理，超声功率300w，超声4s间歇10s，总时长5min。

对超声处理后的溶液进行透析处理，截留分子量30kda，透析3天，透析后溶液旋蒸缩小体积后，冷冻干燥，得到小尺寸的水溶性黑色素纳米粒子粉末。

其粒径分布如图10所示，粒径分布较窄，尺寸小于10nm。

实施例3。

体外培养鼠源黑色素细胞瘤b16f0细胞，培养液为89%dmem高糖培养基+10%fbs+1%青霉素和链霉素，于37℃、5%co2环境中培养。

待细胞培养液颜色变深(棕色、黑色或红棕色)时，取上清液于50ml离心管中，1500r/min离心5min，去除底部沉淀。重复上述步骤2～3次，直至底部无明显沉淀，得含有黑色素粗品的溶液。

使用超声波细胞破碎仪对上述黑色素粗品溶液进行超声处理，超声功率300w，超声4s间歇4s，总时长10min。

使用截留分子量为30kda的超滤离心管，将超声处理后的溶液以6000r/min超滤离心30min，并用去离子水洗涤至少3次。

将超滤离心后的所得物真空干燥，得到小尺寸的水溶性黑色素纳米粒子粉末。

其粒径分布如图11所示，粒径分布较窄，平均粒径10nm。

实施例4。

体外培养鼠源黑色素细胞瘤b16f10细胞，培养液为89%dmem高糖培养基+10%fbs+1%青霉素和链霉素，于37℃、5%co2环境中培养。

待细胞培养液颜色变深(棕色、黑色或红棕色)时，取上清液于50ml离心管中，1500r/min离心5min，去除底部沉淀。重复上述步骤2～3次，直至底部无明显沉淀，得含有黑色素粗品的溶液。

使用热休克的方法对上述黑色素粗品溶液进行提纯，通过反复冻融的方法对黑色素细胞所分泌的囊泡进行膜结构的破坏，以分离提纯黑色素。利用液氮反复冻融3次后，对产物进行透析，透析袋的截留分子量为50kda，透析3天，将透析后的溶液进行旋蒸浓缩体积后，冷冻干燥得到黑色素粉末，其外观如图12所示。

实施例5。

体外培养鼠源黑色素细胞瘤b16f10细胞，培养液为89%dmem高糖培养基+10%fbs+1%青霉素和链霉素，于37℃、5%co2环境中培养。

待细胞培养液颜色变深(棕色、黑色或红棕色)时，取上清液于50ml离心管中，1500r/min离心5min，去除底部沉淀。重复上述步骤2～3次，直至底部无明显沉淀，得含有黑色素粗品的溶液。

在黑色素粗品溶液中加入碱液，利用细胞破碎仪对黑色素粗品进行纯化。超声功率300w，超声4s间歇4s，总时长2min。

超声后，将溶液的ph值调至中性。再利用截留分子量为30kda的超滤离心管进行纯化，并用去离子水洗涤至少3次。

将所得产物进行冷冻干燥，即可得到黑色素纳米粒子粉末。

本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。