一类单光子上转换五甲川菁类光敏染料、其制备方法和应用

1.本发明涉及精细化工技术领域，尤其涉及一类单光子上转换五甲川菁类光敏染料、其制 备方法及应用。


背景技术：

2.光动力学疗法(photodynamic therapy,pdt)是将光化学、光物理学及光生物学的原理 应用于诊断和治疗疾病的一种方法，是继手术、化疗、放疗之后的第四种疗法，在治疗癌症 等恶性疾病以及多种良性疾病方面表现出巨大的应用潜力。
3.光动力治疗的三要素分别是：光源、光敏剂和氧气。其中光源所发射出光的波长很大程 度上决定了光动力治疗实体肿瘤的治疗深度。因此，开发能够被长波长光激发的光敏染料一 直是研究的热点。虽然通过化学改性增大有机分子的共轭程度以延长光敏分子的激发波长是 最为直接有效的方法，但复杂、繁琐的合成手段，减弱的化学、光稳定性和降低的溶解度和 生物安全性总是困扰着研究者对近红外光敏剂的设计与开发。
4.光子上转换介导的光敏剂活化是一类不牺牲目标光敏剂光物理、化学性质，溶解性和生 物相容性的技术手段。利用低能长波长激发光去通过分子间、分子内能量转化激发光敏剂， 发射出高能短波长荧光的同时产生活性氧破坏癌细胞。当前实现光子上转换活化光敏剂技术 主要依赖于稀土上转换纳米粒子和双光子激发材料。然而受限于多光子激发的活化过程，通 过以上两种手段激发光敏剂均需要采用强功率的激光，特别是双光子激发材料，所采用的激 光器更是为高能的飞秒激光器，不利于临床应用。热带吸收频率上转换现象存在于有机荧光 团分子中，该类荧光团通常具体大的摩尔消光系数、明亮的荧光发射和小的斯托克斯位移。 利用该类荧光团中电子在基态高振动、转动能级分布，选择特定长波长光激发处于高振动能 级的电子，进而形成大的反斯托克斯位移，有利于减小常规荧光成像中激发光对荧光发射捕 获的干扰。更为重要的是，诱导该类上转换发生的过程是单光子激发过程。这大大降低了激 发光的光剂量，降低了激发光自身对组织和细胞的损伤。
5.当前已报道的具有单光子上转换性质的荧光指示剂包括半花菁类染料、氟硼二吡咯类染 料、七甲川花菁类染料，罗丹明类染料和吩恶嗪类染料。为增强其光敏化产活性氧能力，当 前主流策略是利用重原子效应。但重原子修饰诱导增强的暗毒性，降低的光、化学稳定性， 不良的溶解性和低的经济性不利于其向临床转化。
6.与典型的光敏剂母体结构不同，天然具有阳离子结构的花菁染料是一类广泛用于生物领 域的化学传感器，能够同时满足具有挑战性的要求，包括：1.在近红外区具有大的消光系数 保证进一步上转换的激发波长；2.明确的亚细胞定位，光敏剂靶向重要的细胞器(例如，线 粒体或内质网)，能有效提高治疗效果；3.阳离子柔性结构，溶解性、生物相容性良好和能 够有效富集在在肿瘤区域。但现有的pdt光敏剂存在依赖重原子和上转换激发产生活性氧量 子产率有限的缺点。因此，开发基于花菁染料的无重原子单光子上转换光敏剂是极有意义并 富有挑战的。


技术实现要素：

7.本发明旨在提供一类能够不依赖于重原子具有单光子上转换性质、线粒体定位的新型 pdt光敏剂。
8.本发明首先提供一类单光子上转换五甲川菁类光敏染料，具有如下结构通式i：
[0009][0010]
通式i中：
[0011]
r1和r2各自独立地选自h、cl、f、羧基、磺酸基等中的一种；
[0012]
r3和r4各自独立地选自甲基、乙基、丙基、长烷基链、苄基等中的一种；
[0013]
ar1选自式i～iv所述基团中的一种：
[0014][0015]
x选自碘、氯或溴中的一种。
[0016]
另一方面，本发明提供上述具有单光子上转换性质的五甲川菁类光敏染料的制备方法， 包括式ii的化合物与式iii化合物在零价钯存在条件下反应的步骤，
[0017][0018]
通过上述本发明的合成方法制备的具有单光子上转换性质的五甲川菁类光敏料，具有以 下显著的特征：1、摩尔消光系数大(》200000m-1
cm-1
)，最大吸收波长位于近红外区(》650 nm)，能够被近红外光激发；2、阳离子结构能够定位于线粒体；3、能够被近红外上转换光 激发(760nm，最大荧光发射波长为670nm)产生单线态氧并破坏癌细胞；4、生物相容性 好，能够快速的在肿瘤富集并代谢；5、能够对活体内对深层组织下实体肿瘤产生抑制作用。
[0019]
基于此，本发明进一步提供所述的单光子上转换五甲川菁类光敏染料在制备pdt光敏剂、 制备光动力治疗药物，以及制备抑制深层组织下癌细胞、肿瘤生长的药物中的应用。所制备 的pdt光敏剂可以用于光动力治疗，以近红外上转换光激发，并且显然相对于一般的光敏剂 有着对深层组织下肿瘤细胞更强的光动力治疗效果。
[0020]
对于pdt光敏剂的更为具体的探讨，与本发明的化合物相对于未经修饰的五甲川
花菁染 料光物理性能提升有关。对于已报道的花菁类光敏剂，本发明的单光子上转换五甲川菁类光 敏染料能够在不损失优异光物理性质的同时提升上转换光激发下染料的单线态氧产生能力。 本发明提供的光敏剂有着特异性的亚细胞器定位，有着更强的治疗效果，并且由于该光敏剂 还可以用长于最大吸收波长100nm以上的近红外光(760nm)激发，一定程度上增加了治疗 的深度。基于此，上述应用中的pdt光敏剂，优选用于对癌细胞、实体肿瘤的荧光成像，并 在上转换光激发光的存在下诱导深层组织下癌细胞、肿瘤的死亡。
附图说明
[0021]
本发明附图如下：
[0022]
图1是对本发明的光敏剂xan-cy5进行单线态氧产生能力测试图。图1中：分别是未 经修饰的五甲川菁染料cy5，苯环修饰的五甲川菁染料ph-cy5和xan-cy5与dpbf(3-二 苯基异苯并呋喃)的混合溶液在760nm的光照射下dpbf在415nm处的吸收衰减归一量化 曲线。
[0023]
图2是对光敏分子xan-cy5的上转换荧光激发图。
[0024]
图3是本发明的光敏分子xan-cy5对4t1细胞的共聚焦成像细胞摄取量图。图3中：a 图是对xan-cy5的共聚焦成像图，b图是对荧光成像的数据量化图。
[0025]
图4是本发明的光敏分子xan-cy5在4t1细胞中的亚细胞器定位图。图4中：a,b,c 和d图中分别表示商品化细胞核染料染色，xan-cy5染色，染色叠加，叠加定位系数图； e,f,g和h图分别表示商品化溶酶体染料染色，xan-cy5染色，染色叠加，叠加定位系数 图；i,j,k和l图分别表示商品化线粒体染料染色，xan-cy5染色，染色叠加，叠加定位系 数图。
[0026]
图5是本发明的光敏分子xan-cy5对4t1细胞在正常和深层组织(5mm)下的光暗毒 性测试。图5中：所选用的激发光为760nm近红外光源，光剂量为500mw cm-2
,15min。
[0027]
图6是本发明的光敏分子xan-cy5在活体皮下肿瘤模型中的荧光成像实验。图6中： a图是xan-cy5在活体皮下肿瘤模型中的荧光成像图；b图是a图的数据量化图。
[0028]
图7是光敏分子xan-cy5在深层活体抗肿瘤模型中的光动力抑瘤实验。图7中：a图 是经过xan-cy5光动力治疗14天后解剖的肿瘤；b图是经xan-cy5光动力治疗后活体肿 瘤体积的变化；c图是经xan-cy5光动力治疗后活体体重的变化。
具体实施方式
[0029]
本发明的具有单光子上转换性质的五甲川菁类光敏染料，具有如下结构通式i：
[0030][0031]
r1和r2各自独立地选自h、cl、f、羧基、磺酸基等中的一种；
[0032]
r3和r4各自独立地选自甲基、乙基、丙基、长烷基链、苄基等中的一种；
[0033]
ar1选自式i～iv所述基团中的一种：
[0034][0035]
x选自碘、氯或溴中的一种。
[0036]
优选的，所述的r1、r2分别为氢。
[0037]
优选的，所述r3和r4分别为乙基。
[0038]
优选的，所述的x为碘。
[0039]
优选的，所述的ar1选自式i,ii,iii,iv所述基团中的一种。
[0040]
上述优选技术特征之组合可以获得本发明的优选的化合物，其中代表性的最优选化合物 是xan-cy5：
[0041][0042]
另一方面，本发明提供所述的一类单光子上转换五甲川菁类光敏染料的制备方法，包括 式ii的化合物与式iii化合物在零价钯存在条件下反应的步骤，
[0043][0044]
其中，式ii的化合物与式iii化合物的摩尔比可为1:1～10，优选为1:2～4，更优选为1:2～3， 最佳为1:2.5。
[0045]
优选的，其中所述的零价钯选自四三苯基膦钯、三二亚苄基丙酮二钯、醋酸钯搭配磷配 体中的一种；
[0046]
优选的，所述的零价钯与式ii的化合物的摩尔比为1:0.01～0.10，优选1:0.08。
[0047]
优选的，所述的反应的溶剂选自1,4-二氧六环或二甲基亚砜，便于反应物的溶解。
[0048]
实际生产操作中，优选使式iii的化合物的加入量稍过量于中间体ii，以利于中间体ii 反应完全。
[0049]
另一方面，该步骤优选在惰性气体保护下进行反应，这样可以使产率更高。
[0050]
反应是否达到终点通过薄层色谱(tlc)判断，通常的反应时间优选4-12小时。
[0051]
反应结束后，蒸去溶剂。优选用二氯甲烷/甲醇作为洗脱液进行色谱柱分离提纯产物。产 物通过核磁和高分辨质谱进行表征。
[0052]
所得光敏剂可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。
[0053]
另一方面，本发明提供所述的一类单光子上转换五甲川菁类光敏染料在制备pdt光敏剂、 制备光动力治疗药物，以及制备抑制深层组织下癌细胞、肿瘤生长的药物中的应用。
[0054]
优选的，所述的pdt光敏剂具有亚细胞器(线粒体)定位特性、和\或具有近红外区拥 有大摩尔消光系数特性、和\或单光子上转换发光性能、和\或具有在长于自身荧光发射的近红 外上转换光激发单线态氧的产生能力。
[0055]
本发明合成方法制备的单光子上转换五甲川菁类光敏染料，具有以下显著的特征：1、摩 尔消光系数大(》200000m-1
cm-1
)，最大吸收波长位于近红外区(》650nm)；2、阳离子结 构能够定位于线粒体；3、能够被长于自身最大吸收波长100nm的近红外光(760nm)激发， 并产生单线态氧并破坏癌细胞；4、生物相容性好，能够快速的在肿瘤富集并代谢；5、能够 在活体内对深层实体肿瘤抑制。
[0056]
本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有 技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。
[0057]
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明及其有益效果， 但不以任何方式限制本发明。
[0058]
实施例1.光敏分子xan-cy5的合成：
[0059][0060]
(1)中间体化合物3的合成：
[0061]
将化合物2(0.34g，1mmol)，季铵盐1(0.63g，2mmol)和无水乙酸钠(0.2g， 2.5mmol)的无水乙醇溶液回流搅拌2h。冷却后，将乙醇通过旋转蒸发仪旋干，后将 粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷/甲醇＝10：1，v/v)，得到化合物3，为 蓝色粉末(0.53g，71.8％)。1h nmr(400mhz,meod):8.41(d,j＝13.3hz,2h,ch),7.56 (d,j＝7.4hz,2h,arh),7.46(t,j＝7.6hz,2h,arh),7.40(d,j＝7.8hz,2h,arh),7.33(t,j＝ 7.4hz,2h,arh),6.49(d,j＝13.3hz,2h,ch),4.24(q,j＝7.2hz,4h,ch2),1.76(s,12h,ch3), 1.45(t,j＝7.2hz,6h,ch3).esi-ms(c
29h34
brn2i)m/z:[m
–
i]-calcd.489.19；found,489.28.
[0062]
(2)光敏分子xan-cy5的合成：
[0063]
将3(0.1g，0.16mmol),4(0.084g，0.25mmol)和四三苯基膦钯(0.0092g，0.008mmol)， 碳酸钾(0.066g，0.48mmol)溶解在10ml的1,4-二氧六环中，并在90度下搅拌8小时。最终 蒸发溶剂，并将混合物通过硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷/甲醇＝100：0.8，v/v)，得到蓝 黑色固体粉末xan-cy5(17％)。1h nmr(400mhz,meod)δ(ppm):8.61(d,j＝14.1hz,2h), 8.49(d,j＝14.1hz,2h),8.30(d,j＝8.7hz,1h),8.10
–
8.04(m,2h),7.57
–
7.53(m,4h),7.43 (ddd,j＝21.6,11.6,4.1hz,4h),7.29(t,j＝7.3hz,2h),7.23(d,j＝7.9hz,2h),5.94(d,j＝14.1 hz,2h),3.76(q,j＝7.1hz,4h),1.84(s,12h),1.11(t,j＝7.2hz,6h).
13
c nmr(126mhz, meod)δ(ppm):174.51,154.57,142.91,133.73,133.11,132.38,130.83,130.46,129.80,129.29, 128.84,127.46,127.00,126.53,123.53,111.85,102.29,50.71,39.94,27.81,12.13.esi-ms (c
43h43
in2)m/z:[m
–
i]-calcd 587.34,found 587.47.
[0064]
实施例2.光敏分子xan-cy5的单线态氧性能测试
[0065]
将2μm的光敏分子xan-cy5加入到含有3ml二氯甲烷溶液的测试石英皿，通过dpbf 溶液调整415nm处的吸光度达到1左右，将皿置于760nm，500mw/cm2的光源下照射，每 隔120秒记录溶液的吸收光谱。测试结果整理在显示于图1中，溶液的吸收随照射时间的增 长按一定的值同等衰减，表明溶液在该波长的光源照射下产生了单线态氧。
[0066]
实施例3.xan-cy5的上转换激发荧光测试
[0067]
将2μm的化合物xan-cy5置于3ml的二氯甲烷溶液中。采用760nm激发，捕获 630-700nm的荧光发射。如图2是光敏分子xan-cy5的上转换荧光激发图
[0068]
实施例4.光敏分子xan-cy5的细胞摄取实验
[0069]
4t1细胞在dmem(invitrogen)中用10％的fcs(invitrogen)培养。将1μm的化合 物xan-cy5加入到含有4t1细胞的培养液中，37℃下孵育，后采用共聚焦成像的方式判断 摄取量。光敏分子激发波长为640nm，探针发射波长675nm，测试结果显示于图3的a和b 图中。从图中可以看到，光敏化合物xan-cy5在4t1细胞中的摄取量在孵育60min后达到 饱和。表明光敏化合物xan-cy5容易被细胞摄取。
[0070]
实施例5.光敏分子xan-cy5的亚细胞器定位实验
[0071]
4t1细胞在dmem(invitrogen)中用10％的fcs(invitrogen)培养。共聚焦荧光成像实 验前一天，细胞种在细胞共聚焦培养皿中。图5是光敏分子与不同亚细胞器定位的商业化染 料复染实验。光敏分子xan-cy5的浓度为1μm，商业化染料hochest 33342(细胞核)、 mtg(线粒体)、ltg(溶酶体)的浓度分别为100nm。先将1μm的光敏分子xan-cy5 分别加入至3个含有4t1细胞的皿中孵育2小时，后分别将3种100nm的商业化染料加入 皿中分别孵育5min、30min和20min，随后进行激光共聚焦成像。光敏分子xan-cy5的激 发波长为640nm发射为670-710nm。hochest 33342的激发波长为405nm，接受波段为460-490 nm。mtg与ltg的激发波长均为488nm，接受波段为515-545nm。从图4中可以看出 xan-cy5能够较好的定位于4t1细胞的线粒体中。
[0072]
实施例6.光敏分子xan-cy5对4t1细胞的细胞光暗毒性实验
[0073]
将要检测的4t1细胞用0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的dmem培养液配成单 个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μl；将培养板移入 孵箱中，37℃，5％co2及饱和湿度下培育24小时后，分别加入不同浓度的光敏分子，继
续 培养2小时；随后采用760nm，500mw/cm2的近红外光源照射每个孔，照射完毕后，继续 将96孔板放置培养箱中放置24h。每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，孵育4小时，终 止培养，小心吸掉孔内培养上清液。然后，每孔加入100μl的dmso，振荡10分钟，使结 晶物充分溶解；在酶标仪上测定各孔490nm处的吸光度，计算细胞存活率：试验组光吸光度 /对照组吸光度值
×
100％。
[0074]
从图5中可以看出，光敏分子xan-cy5对4t1细胞不管是否在深层组织下均拥有显著 的光诱导杀伤毒性。
[0075]
实施例7：活体皮下肿瘤模型下光敏分子xan-cy5的荧光成像
[0076]
将1
×
106的4t1细胞皮下注射至balb/c雌鼠的腋下，并隔天检测一次。待肿瘤体积长 至150mm3后，将100μm的光敏分子xan-cy5通过静脉注射注入小鼠体内，并通过小动物 荧光成像仪对活体内荧光进行实时检测。染料xan-cy5为650nm激发，收集670-700nm波 段。
[0077]
图6可以看出，光敏分子xan-cy5能够快速的在肿瘤部位富集，并能快速的从体内代 谢，拥有良好的生物相容性。
[0078]
实施例8：活体转移瘤模型下光敏分子xan-cy5的抑瘤实验
[0079]
将100μm的光敏分子xan-cy5通过静脉注射注入小鼠体内，在注射10min后，对肿 瘤处采用760nm光(500mw/cm2)照射15min。在第一次治疗的3天后，再进行一次相同 的实验。从治疗第一天开始，隔天记录一次小鼠的体重和肿瘤体积。在第一次治疗14天后， 对小鼠进行解剖去除肿瘤与肺组织，进行分析实验。
[0080]
从图7(a代表对经过光敏分子xan-cy5治疗14天后的小鼠解剖得到的肿瘤组织；b 图代表经xan-cy5光动力治疗后活体肿瘤体积的变化；c图代表经xan-cy5光动力治疗后 活体体重的变化)中可以看出，光敏剂xan-cy5的光动力治疗作用显著地抑制了肿瘤的生 长。在整个治疗过程中，各组小鼠的体重没有变化，表明xan-cy5在拥有高效的肿瘤治疗 效果的同时没有毒副作用，生物相容性良好。
[0081]
对比例1.未经修饰的五甲川菁染料分子的单线态氧性能测试
[0082]
将2μm的参比未修饰的五甲川菁染料cy5加入到含有3ml二氯甲烷溶液的测试石英 皿，通过dpbf溶液调整415nm处的吸光度达到1左右，将石英皿置于760nm，500mw/cm2的氙灯光源下照射，每隔120秒记录溶液的吸收光谱。测试结果显示于图1中。通过分析图 1可以说明目标化合物xan-cy5提高了传统五甲川菁染料分子在上转换光激发下的单线态氧 产生性能。
[0083]
对比例2.苯基修饰的五甲川菁染料分子的单线态氧性能测试
[0084]
将2μm的参比meso位为苯基修饰的五甲川菁染料ph-cy5加入到含有3ml二氯甲烷溶 液的测试石英皿，通过dpbf溶液调整415nm处的吸光度达到1左右，将石英皿置于760nm， 500mw/cm2的氙灯光源下照射，每隔120秒记录溶液的吸收光谱。测试结果显示于图1中。 通过分析图1可以说明目标化合物xan-cy5提高了五甲川菁染料分子的上转换单线态氧产 生性能具有相对特异性。
[0085]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领 域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。