一种绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物无机复合材料制备技术领域，具体涉及到层层自组装法制备绿色荧光蛋白/LDHs复合发光超薄膜的方法，并对其性能作出评价。
【背景技术】
[0002]绿色焚光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)于1962年被发现，由于它可以发出稳定的荧光，没有毒性，不具有物种专一性，且易于在细胞内表达，已作为标记物广泛地应用于生命科学领域。当GFP基因与目的蛋白基因融合并在生物体内表达时，目的蛋白仍保持正常活性，且GFP能够保持其荧光，故可以跟踪目的蛋白的定位、移动及其它活动。作为最有效的活细胞标记物质，荧光蛋白可用于研宄基因表达调控、生物大分子相互作用、胚胎发育以及发展生物传感器等。在应用过程中除要选择合适的荧光强度、激发和发射波长(特别是FRET和多色标记时)、生色团成熟时间、密码子偏好性和物种差异，还需考虑细胞所处环境(温度、PH、离子强度和种类等)。另外，荧光蛋白的寡聚可能会影响融合蛋白的正确定位和迀移，而几乎所有荧光蛋白都有寡聚趋势，通过对有相互作用的侧链氨基酸进行突变可消除这种趋势。
[0003]层状复合金属氢氧化物(Layered Double Hydroxides,简写为LDHs，又称LDHs)是一类典型的阴离子型层状材料，是带正电的二维氢氧化物层板与层间阴离子通过静电相互作用有序堆积形成三维晶体结构，二价和三价金属离子的氢氧化物相互间高度分散并以离子键构成主体层板，层间阴离子有序排布，以静电力平衡主体层板电荷，整体呈现电中性。LDHs主体层板内的二价及三价金属离子的种类、比例和分布以及插层分子均可以人为调控，因此可以设计合成多种功能性复合材料的制备。
[0004]因此，将荧光蛋白作为客体插入到层状材料LDHs的层间，形成生物无机复合薄膜，改变提高荧光蛋白的性能，并实现荧光蛋白固载化，用于研宄荧光蛋白对于一些生物环境的检测，此薄膜有望成为一类新型的生物传感材料。目前，把荧光蛋白引入到层状材料LDHs层间的研宄至今还未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜及其制备方法。
[0006]本发明先利用快速成核晶化隔离法或水热合成法制备了层状复合金属氢氧化物胶体溶液；然后配制荧光蛋白溶液；再将基底用浓硫酸和双氧水处理后，分别用乙醇和水洗涤，最后利用层层自组装的方法制备得到了绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜。
[0007]本发明所述的绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜的制备方法，其具体操作步骤如下:
[0008](I)制备层间阴离子为NO3-,层板二价、三价阳离子摩尔比M2+/M3+= 2的层状复合金属氢氧化物胶体溶液；
[0009](2)配制pH = 7-10的绿色荧光蛋白溶液，浓度为0.1-0.05mg/mL ；
[0010](3)将石英片或硅片放置于浓硫酸和双氧水混合液中浸泡30分钟，然后分别用乙醇和去离子水超声洗涤两次；
[0011](4)将步骤(3)中处理过的石英片或硅片在步骤(I)的胶体溶液中浸泡10-15分钟，用去离子水充分清洗后，再放置于步骤(2)的绿色荧光蛋白溶液中浸泡10-15分钟，并充分清洗，得到一次循环的绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜；
[0012](5)重复步骤(4)中交替浸泡操作2-100次，得到多层绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜。
[0013]步骤(I)所述的层状复合金属氢氧化物胶体溶液的快速成核晶化隔离制备法为:称取 0.06mol 的 Mn (NO3)2.6H20 和 0.03mol 的 Min (NO3)3.9H20 溶于 80ml 去(:02去离子水中，记为A溶液；称取0.18mol NaOH溶于80ml去CO2去离子水中，记为B溶液；将A溶液和B溶液同时加入全返混液膜反应器，调节反应器转子与定子之间的狭缝宽度为2_，工作电压为140V，转子转速为5000rpm，将得到的混合浆液转移到反应釜中，110°C晶化24小时后用去离子水充分洗涤，取第四次离心液即为层状复合金属氢氧化物胶体溶液。
[0014]步骤(I)所述的层状复合金属氢氧化物胶体溶液的水热合成法为:称取0.0lmol的 M11 (NO3)2.6Η20 和 0.02mol 的 Min (NO3) 3.9Η20 溶于 80ml 去 CO2去离子水中；称取 0.12mol六次甲基四胺溶于120ml去CO2去离子水中；将两溶液倒入四口烧瓶，边搅拌边混合，同时通氮气I小时，然后80°C水浴加热搅拌反应3天；用去CO2去离子水离心洗涤pH至6.5-7.0，称取5g离心沉淀溶于10mL去CO2去离子水中，通氮气30分钟后置于120°C烘箱12个小时，取出后以2000rmp的速度离心30分钟，取上层液即为层状复合金属氢氧化物胶体溶液。
[0015]所述的Mn为Mg2+，Zn2+，Ni2+中的任何一种；所述的M 111为Al3+。
[0016]上述制备得到的绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜可逆检测PH值的应用。
[0017]本发明制备得到的绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜实现了荧光蛋白的固载化，其在PH = 4-8的环境下荧光强度不同，随pH的减小该复合发光超薄膜的荧光强度降低，且在PH值为4和8的两种PBS溶液中交替浸泡时，其荧光响应可至少重复5个循环。由于该复合发光超薄膜具有较好的pH响应的稳定性和可重复性，可用于生物体内pH环境的可逆检测，提高了荧光蛋白的利用率，为荧光蛋白在生物传感器上的应用研宄以及其他性能的研宄提供基础。此薄膜有望成为一类新型的生物传感材料。
【附图说明】
[0018]图1是从实施例1得到的LDHs的XRD图。
[0019]图2是从实施例1得到的绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜的小角XRD图。
[0020]图3是从实施例1得到的镁铝硝酸根LDHs、绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜以及空白样品的ATR-FTIR图。
[0021]图4是从实施例1得到的绿色荧光蛋白溶液的荧光光谱。
[0022]图5是从实施例1得到的不同层数的绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜的荧光光谱图以及荧光强度与层数的线性关系。
[0023]图6是从实施例1得到的不同层数绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜的SEM图。
[0024]图7是从实施例1得到的绿色荧光蛋白溶液的⑶谱。
[0025]图8是从实施例1得到的重复20次操作的绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜的CD谱。
[0026]图9是从实施例2得到的绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜在不同pH条件下的焚光光谱。
[0027]图10是从实施例2得到的绿色荧光蛋白与层状复合金属氢氧化物复合发光超薄膜在pH = 8和pH = 4的PBS溶液中交替浸泡时，其荧光强度变化情况。
【具体实施方式】
[0028]下面通过具体的实施例来进一步解释本发明。
[0029]实施例1
[0030]1.采用快速成核晶化隔离法制备LDHs，具体方法为称取15.385gMg(NO3)2.6H20和11.254g Al(NO3)3.9Η20溶于80ml去CO2去离子水中，记为A溶液，Mg 2+/Α1 3+摩尔比为2:1 ;称取7.2g NaOH溶于80ml去CO2去离子水中，记为B溶液；将A和B两种溶液同时加入全返混液膜反应器，调节反应器转子与定子之间的狭缝宽度为2_，工作电压为140V，转子转速为5000rpm，将得到的混合浆液转移到反应釜中，110°C晶化24小时后用去离子水充分洗涤，取第四次离心液即为镁铝LDHs胶体溶液。离心底物于60°C干燥18小时，得到干燥的镁铝LDHs。
[0031]2.取Img绿色荧光蛋白溶解在pH = 7.4的PBS(50mM)缓冲溶液中，配制成0.1mg/mL的绿色荧光蛋白溶液；
[0032]3.将石英片放置于体积比为7:3的浓硫酸和双氧水的混合溶液中浸泡30分