一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种双光子染料及其应用，尤其设及一种具有大双光子巧光活性截面 的膜通透性染料及其应用。
【背景技术】
[0002] 双光子显微镜的发展已经彻底改变了对器官和组织、特别是厚的或高散射的标本 的观测。与单光子激光共聚焦显微镜相比，双光子显微镜具有诸如近红外光激发、避免巧光 漂白和光致毒、高分辨率、减小组织吸光及降低组织自发巧光干扰等特点。但是，如果所用 巧光探针的双光子吸收截面小（与生物样品的内源性发光物质相近），那么双光子显微镜 优势会被大打折扣。因为染料的单、双光子吸收服从不同的选律，所W优良的单光子染料不 一定具有大的双光子吸收截面。目前用于激光共聚焦显微镜的单光子染料几乎都不具备大 的双光子巧光活性吸收截面。因而，针对该技术的双子染料和探针的研究成为一个热口课 题。
[0003] 最近，许多课题组报道了大量的双光子染料和探针。虽然近期报道的双光子染料 具有大的双光子巧光活性吸收截面，但是常用的双光子染料依旧是罗丹明（吸收截面只有 200GM左右）。运是因为罗丹明具有良好的膜通透性。细胞膜通透性是一个优良生物巧光 染料的重要参数。目前，生物巧光成像中所使用的染料很少同时具备大的双光子巧光活性 吸收截面和良好的细胞膜通透性。运在很大程度上制约了利用双光子=维成像技术进行细 胞生物成像与观测。因而开发、研制具有实际应用价值的双光子膜通透性巧光染料是当务 之急。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有大双光子巧光活性截 面的膜通透性染料及其应用。
[0005] 本发明所述具有大双光子巧光活性截面的膜通透性染料，其特征在于：所述染料 是=苯胺杂环类化合物，其化学结构通式如式（I)所示：
[0006]
(I)
[0007] 其中：上述式中R表示NH或S原子。
[0008] 上述具有大双光子巧光活性截面的膜通透性染料通式（I)中所述R优选表示S原 子。
[0009] 上述具有大双光子巧光活性截面的膜通透性染料具体优选是4-[巧苯 并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧)-2-(1H-苯并嚷挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯 胺。
[0010] 本发明所述具有大双光子巧光活性截面的膜通透性染料苯胺杂环类化合物） 的制备方法概述如下：
[0011] 发明人首先通过Wilsmeier反应在立苯胺上引入两个醒基，然后利用Wittig反 应再引入两个双键，最后利用与邻琉基苯胺、邻二苯胺、或邻径基苯胺的扣环反应得到终产 物一一=苯胺杂环类化合物。
[0012] 上述=苯胺杂环类化合物具体制备反应式如下：
[0013]
4-胆)-2-(lH-苯并唾峨-2-基)己婦基]-N-H-胆)-2-(旧- 苯并唾嗤-2-基)艺帰萄苯基}-N-苯基苯胺 威：
4-脾苯并咪睡-2-基)乙婦基]-N-H-KE) -2-( 1H-苯并咪哩-2-基)己締基]苯基} -N-苯基苯胺
[0014] 本发明所述具有大双光子巧光活性截面的膜通透性染料在显示活细胞中细胞质 双光子成像中的应用。
[0015] 其中，所述活细胞优选为化La细胞或RBk2H3细胞；在细胞质中无祀向性。
[0016] 试验结果证实，本发明所述具有大双光子巧光活性截面的膜通透性染料（=苯胺 杂环类化合物）能够很容易的通过细胞膜，在细胞质区域呈现出明显的巧光显微图像，运 为应用双光子显微镜成像活细胞中细胞质的研究提供了有益的帮助，同时也为开发简捷、 直观的巧光检测试剂提供了技术支持。
[0017] 本发明的有益效果是：利用实验筛选，本发明确立了一类新型具有大双光子巧光 活性截面的膜通透性染料，即=苯胺杂环类化合物。本发明所述=苯胺杂环类化合物具有 价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好的特点。进一步的试验证实，本发明的立苯胺 杂环类化合物具有比较大的双光子巧光活性吸收截面、优秀的细胞膜通透性和低毒性等特 点。并且本发明所述的染料和已有的探针DAPI具有良好生物相容性，在激光激发巧光生物 标记领域具有潜在的应用价值。也预示本发明所述=苯胺杂环类化合物作为双光子巧光染 料具有广阔应用前景。
【附图说明】
[001引 图1 :4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基} -N-苯基苯胺对活性化Ia和1?心甜3细胞进行染色在单光子共 聚焦巧光显微镜下得到的巧光显微照片。
[0019] 其中a图为用4-[似苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯 并嚷挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的巧光显微照片；b图为明场照片；C 图为左中两图的合并图即共定位图。
[0020] 图2 :4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基} -N-苯基苯胺对活性化Ia和1?心甜3细胞进行染色后在800纳 米激光福照下得到的双光子巧光显微照片。
[0021] 其中a图为用4-[似苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯 并嚷挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的双光子巧光显微照片；b图为明场 激光扫描的微分显微照片；C图为左中两图的合并图。
[0022] 图3 :4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基} -N-苯基苯胺和舰化丙晚对活化Ia细胞进行染色后，分别在405 和561纳米激光福照下分为两个通道收集得到的单光子共聚焦巧光显微照片。
[0023] 其中a为405纳米激发绿色通道的照片，b为561纳米激发红色通道的照片，C为 明场照片，d图为曰、b、CS者合并图片。
[0024] 图4:4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺、DAPI分别依次对活性化Ia细胞进行染色后在， 分别在405和561纳米激光福照下分为两个通道收集得到的单光子共聚焦巧光显微照片。 [00巧]其中a为绿色通道的照片，b为蓝色通道的照片，C图为前两者合并图片。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1:
[0027] 4, 4-2甲酯基S苯胺的合成
[0028] 将20ml的DMF加入到单口烧瓶中。在冰水浴揽拌下，向上述溶液中缓慢滴加=氯 氧憐20ml，室溫揽拌比，得到黄色浑浊液。称取=苯胺5g(20. 4mmol)，用IOml=氯甲烧将其 溶解，然后再逐渐加入上述揽拌的溶液中，加热回流反应10小时。将反应液倾入到1000 mL 水中，用CH2CI2萃取。有机层用饱和氯化钢溶液洗涂，无水MgSO4干燥，过滤，蒸除溶剂。粗 产品用柱色谱分离，石油酸/乙酸乙醋（10 : 1)作淋洗液，得到浅黄色固体，即为4, 4-2甲 酷基=苯胺。产率：55%。
[0029]IhNMR(400MHz,d6-DMS0) : 5 (ppm) 9. 88(S,2H)，7. 85 (d,J= 8. 64Hz, 4H) , 7. 49 (t,J= 7. 84Hz, 2H) , 7. 33 (t,J= 7. 4Hz,IH), 7. 22 (d,J= 8. 4Hz, 2H)，7. 17 (d,J= 8. 56Hz, 4H).
[0030] (2E，沈)-3, 3 (苯基苯胺）2 (1，4-亚苯基）丙締醒的合成
[00引]将化41邑，8臟〇^4,4-2甲酯基^苯胺和化24邑，19.2臟〇^(1，3-二氧戊环-2甲 基）-S苯基漠化麟加入到S口烧瓶，加入100mLS氯甲烧将其溶解。在室溫和氮气保护下 揽拌30分钟。然后再加入（12.68g，112mmol)叔下醇钟。再继续反应24小时。将反应液 倾入到1000 mL水中并在其中揽拌6小时，用CH2CI2萃取。有机层用饱和氯化钢溶液洗涂， 无水MgS〇4干燥，过滤，蒸除溶剂。粗产品用柱色谱分离，石油酸/乙酸乙醋（4 : 1)作淋 洗液，得到黄色固体，即为（2E，沈)-3,3(苯基苯胺）2(1,4-亚苯基）丙締醒。产率：57%。 [003引IhNMR(400MHz, (16-DMS0) : 5 (ppm) 9. 64 (d,J= 7. 8Hz, 2H)，7. 7 (t,J =9.08Hz, 6H), 7.44 (t,J= 7.78Hz, 2H), 7.26 (t,J= 7.36Hz,IH), 7.17 (d,J= 7. 75Hz, 2H)，7. 06 (d,J= 8. 56Hz, 4H)，6. 77 (dd,Ji=J2= 7. 8Hz, 2H).
[0033] 4-[巧)-2- (IH-苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N- {4-[巧)-2- (IH-苯并嚷挫-2-基）