氯化钙在增强真菌土壤降镉能力中的应用及方法

本发明属于重金属污染控制领域，涉及土壤中重金属镉的去除，特别是指氯化钙在增强真菌土壤降镉能力中的应用及方法。

背景技术：

随着工业的快速发展，未经处理的工业废水的排放使我国多地土壤和水中镉污染严重。

土壤和水中镉污染半衰期长，难降解，容易通过植物、食用菌等食物经生物链富集进入人体，引起免疫力降低、肝损伤、肾损伤、骨损伤等，严重的还会致癌。因此，修复镉污染的土壤和水，对人类健康意义重大。

现有修复镉污染土壤和水的技术一般有物理化学处理方法和生物处理方法。物理方法一般成本高，化学方法一般有二次污染，生物处理由于安全环保越来越受到关注。

生物修复有两种，一种依靠高镉抗性植物在生长过程中对镉的吸收，来降低土壤和水中镉的浓度，耗时长，成本高。另一种依靠活的或死的真菌来吸附镉，一般活菌吸附效果比死菌好。专利cn112080436a报道了“一种高镉抗性大型真菌菌株及其应用”，将含大型真菌菌株pleu-jn21-2f1菌丝的培养基质埋入土壤中，通过菌体生长去除重金属，达到修复的目的；专利cn111876339a报道了“一种重金属耐受性酵母菌及其应用”，筛选了一株重金属耐受性酵母，为该菌在修复水体、土壤等重金属污染打下基础。但上述方法去除镉的效果不佳。若有方法能增强上述菌株去除镉的能力，则这些方法修复镉污染水或土壤的效果将会大大增强。

技术实现要素：

本发明提出一种氯化钙在增强真菌土壤降镉能力中的应用及方法，通过将氯化钙10-320毫克溶于1l水中制成真菌降镉强化液。在利用真菌修复污染土壤的同时，喷洒真菌降镉强化液，显著增强真菌富集镉的能力（5.7-6.9倍），以达到提高真菌修复环境效果，具有操作简便、成本低、效果好，无二次污染等特点。

本发明的技术方案是这样实现的：

氯化钙在增强真菌降镉能力中的应用，所述氯化钙为氯化钙溶液。

所述真菌为香菇菌株。

所述氯化钙溶液的浓度为10-320mg/l。

氯化钙增强真菌降镉能力的方法，利用氯化钙降低菌丝体内丙二醛浓度，减少镉对香菇的负面影响，具体步骤为：将浓度为10-320mg/l的氯化钙溶液喷洒在含有真菌的土壤上。

上述的方法在修复镉污染土壤中的应用，先将活化的10ml真菌菌丝接种于3kg原基诱导培养基中培养，获得菌棒，将原基形成后的菌棒平铺成15cm移入含镉土壤表面，再在菌棒表面喷洒150ml10-320mg/l的氯化钙溶液，长成的香菇经出菇后完成对镉污染土壤的修复。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供一种强化真菌降镉能力的技术，通过在利用真菌修复污染土壤的同时，喷洒真菌降镉强化液，不仅可以减少镉对真菌的毒害，增强真菌生命力，还能促进真菌的生长，从而显著增强真菌富集镉的能力5.7-6.9倍，具有适用范围广，效果好，成本低，无二次污染等特点。

2、本申请发现氯化钙溶液可以通过降低丙二醛浓度，使其在菌丝体内恢复正常状态，甚至更低来降低氧化应激程度；通过提高超氧化物歧化酶（sod）、过氧化氢酶（cat）、谷胱甘肽浓度来提高抗氧化性，减少镉对真菌的毒害，修复香菇自身的氧化应激，增强真菌生命力，促进真菌生长，有效提高真菌降镉能力，提高真菌修复镉污染土壤的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同处理下的香菇菌丝生长状况，其中ck为对照组，cd为2mg/lcd处理组，cd+10mg/lca为2mg/lcd+10mg/lca处理组，cd+20mg/lca为2mg/lcd+20mg/lca处理组，cd+50mg/lca为2mg/lcd+50mg/lca处理组，cd+70mg/lca为2mg/lcd+70mg/lca处理组，cd+100mg/lca为2mg/lcd+100mg/lca处理组，cd+150mg/lca为2mg/lcd+150mg/lca处理组。

图2为不同处理下香菇菌丝中cd和ca的含量，其中ck为对照组，cd为2mg/lcd处理组，10ca为2mg/lcd+10mg/lca处理组，20ca为2mg/lcd+20mg/lca处理组，50ca为2mg/lcd+50mg/lca处理组，70ca为2mg/lcd+70mg/lca处理组，100ca为2mg/lcd+100mg/lca处理组，150ca为2mg/lcd+150mg/lca处理组。不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

图3为不同处理下培养基中剩余cd和ca的含量，其中，ck为对照组，cd为2mg/lcd处理组，10ca为2mg/lcd+10mg/lca处理组，20ca为2mg/lcd+20mg/lca处理组，50ca为2mg/lcd+50mg/lca处理组，70ca为2mg/lcd+70mg/lca处理组，100ca为2mg/lcd+100mg/lca处理组，150ca为2mg/lcd+150mg/lca处理组。不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

图4为不同处理下香菇菌丝中mda、sod、cat和gsh的活性，其中ck为对照组，cd为2mg/lcd处理组，10ca为2mg/lcd+10mg/lca处理组，20ca为2mg/lcd+20mg/lca处理组，50ca为2mg/lcd+50mg/lca处理组，70ca为2mg/lcd+70mg/lca处理组，100ca为2mg/lcd+100mg/lca处理组，150ca为2mg/lcd+150mg/lca处理组。不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

图5为不同处理下香菇菌丝的扫描电镜图，其中a.为ck组，b.为cd处理组，c.为2mg/lcd+20mg/lca处理组，d.为2mg/lcd+50mg/lca处理组。

图6为2mg/l镉胁迫下，添加10mg/l的氯化钙对215菌株菌丝生长情况的影响，其中a为麦芽浸粉：菌丝在麦芽浸粉培养基中生长情况，b为cd：2mg/l镉胁迫下，菌丝在麦芽浸粉培养基中生长情况，c为cd+10ca：2mg/l镉胁迫下，菌丝在添加10mg/l氯化钙的麦芽浸粉培养基中生长情况。

图7为2mg/l镉胁迫下，添加50mg/l的氯化钙对215菌株菌丝生长情况的影响，其中a为麦芽浸粉：菌丝在麦芽浸粉培养基中生长情况，b为cd：2mg/l镉胁迫下，菌丝在麦芽浸粉培养基中生长情况，c为cd+50ca：2mg/l镉胁迫下，菌丝在添加50mg/l氯化钙的麦芽浸粉培养基中生长情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、本申请采用的实验材料：

供试香菇菌种：本研究使用的菌株是从河南省泌阳县真菌研究所获得的香菇菌株215。

培养基配方：麦芽浸粉20g、蛋白胨2g、酵母浸粉1g、去离子水1000ml。

二、实验方法：

2.1香菇菌丝体的制备

在25℃，150r/min的条件下，将菌株在麦芽糖培养基中摇床培养20天进行活化。在接种时使所有处理组中的镉浓度达到2mg/l，然后分别使培养基中含有10mg/lca、20mg/lca、50mg/lca、70mg/lca、100mg/lca和150mg/lca（10mg/lca+cd为2mg/lcd+10mg/lca、20mg/lca+cd为2mg/lcd+20mg/lca、50mg/lca+cd为2mg/lcd+50mg/lca、70mg/lca+cd为2mg/lcd+70mg/lca、100mg/lca+cd为2mg/lcd+100mg/lca、150mg/lca+cd为2mg/lcd+150mg/lca处理组），在25℃，150r/min的条件下摇床培养20天。然后离心收获菌丝体并用去离子水洗涤三次，洗涤后的菌丝进行下一步的实验操作或者放置于-80℃冰箱保存。

2.210%组织匀浆的制备

取适量洗涤后的体于研钵中，加入适量液氮，快速研磨成粉，取粉末称重，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，涡旋混匀，3500r/min离心10min后取上清即10%匀浆上清液。

2.3金属含量的测定

洗涤后的菌丝65℃烘干48h获得香菇菌丝样品。每个样品称取约0.3g（干重）和5ml硝酸进行微波消解，消化后的样品稀释至50ml，然后用icp-ms进行元素分析。测定方法按照gb5009.268-2016。

2.4bradford蛋白浓度测定

取10%组织匀浆，按照bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书进行测定。标准曲线为y=0.1419x+0.3828，r²=0.9963。

2.5mda、sod、cat、gsh含量测定

取10%组织匀浆，分别按照mda、sod、cat、gsh测定试剂盒说明书对其含量进行测定，结果按照组织中蛋白浓度来表示。

2.6扫描电镜分析

将洗涤后的香菇菌丝在4℃2.5%的戊二醛中（0.1mph7左右的pbs缓冲液配置）固定浸泡4小时以上，然后采用0.1mph为7左右的pbs缓冲液洗涤三次，每次10~15min；接着用梯度乙醇（30%、50%、70%、90%、100%、100%）对样品进行脱水，每次5~10min；再用无水乙醇与醋酸异戊酯（1:1）置换一次，100%醋酸异戊酯置换两次，每次置换5~10min；最后用二氧化碳临界干燥仪进行干燥，喷金，在15.0kv加速电压下观察菌丝形貌。

实施例1

取样香菇菌株215品种，在麦芽浸粉液体培养基中添加2mg/l的氯化镉和10mg/l、20mg/l、50mg/l、70mg/l、100mg/l和150mg/l的氯化钙，用麦芽浸粉液体培养基、只添加氯化镉的麦芽浸粉培养基为对照，培养20天，用微波消解-电感耦合等离子体质谱法等测定香菇菌丝中镉含量。

结果如图1所示：ck组菌丝生长正常，cd处理组的菌丝量明显少于其他组，说明cd确实对香菇菌丝造成毒害，影响其正常生长。ca+cd处理组菌丝生长量增加，且与ck组相比菌丝生长状态更好。10mg/lca+cd处理组的菌丝比cd处理组长势好，但是其他处理组相比菌丝量较少，说明10mg/lca只能轻微缓解镉对香菇菌丝的毒害。与ck组相比，ca+cd处理组的菌丝较大且菌丝量较多，说明不同浓度的钙处理可以降低香菇菌丝中镉的毒性使其恢复到ck组，甚至促进菌丝生长，可能是因为ca+cd处理组的菌丝吸收了更多的ca，而ca作为一种营养元素促进了菌丝的生长。

①、在低镉胁迫下外源添加10mg/l、20mg/l、50mg/l、70mg/l、100mg/l和150mg/lca对于香菇菌丝中镉、钙含量的影响，研究结果见图2。

由图2可知，低镉胁迫下外源钙的添加促进了香菇菌丝对镉的吸收，这与李海波等人的研究结果相反。不同浓度的ca对cd吸收的影响是不同的，20mg/lca+cd处理组的菌丝中cd含量是最高的，其次是150mg/lca+cd处理组，而10mg/lca+cd、50mg/lca+cd、70mg/lca+cd和100mg/lca+cd四个处理组之间没有显著性差异（p>0.05），说明在2mg/lcd处理下外源添加一定浓度的ca可以促进香菇菌丝对cd的吸收，这与naokohayakaway等人对gambleainnovans进行钙处理增加了根中的镉浓度结果一致。与ck组和cd处理组相比，ca+cd处理组的cd含量显著增加（p<0.05），但随着ca浓度的增加，菌丝中cd含量的增加幅度不同。随着ca浓度的增加，菌丝中的ca含量也在增加，尤其是150mg/lca+cd处理组的ca含量明显高于其他组。

综上所述，添加一定浓度的ca可以使菌丝中ca含量大幅增加，大幅促进香菇菌丝对cd的吸收。而香菇菌丝中增加的ca和cd可能来源于培养基。

②、低镉胁迫下钙对培养基中镉、钙含量的影响

为了验证香菇菌丝中增加的cd和ca是否来源于培养基，对培养基中cd和ca的含量进行了测定，结果见图3。

由图3可知，培养基中cd和ca的含量与菌丝中cd和ca的含量相对应。如图所示，cd处理组的cd含量明显高于其他处理组（p<0.05），且随ca浓度的增加cd含量逐渐降低，50mg/lca+cd、70mg/lca+cd和100mg/lca+cd三个处理组之间的cd含量没有显著性差异（p>0.05）。20mg/lca+cd处理组和150mg/lca+cd处理组的ca含量最低，和菌丝中这两个处理组的cd含量最高相印证。50mg/lca+cd、70mg/lca+cd和100mg/lca+cd三个处理组之间的ca含量没有显著性差异（p>0.05）。20mg/lca+cd处理组和150mg/lca+cd处理组菌丝中cd含量最高、ca含量最低，推测原因是菌丝吸收了培养基中更多的ca，ca促进了cd的吸收。但ca是如何影响香菇菌丝中cd的吸收暂不清楚，因此评价了氧化应激相关指标。

③、低镉胁迫下钙对香菇菌丝中mda、sod、cat、gsh含量的影响

发明人进一步推测ca对cd吸收的促进作用是通过氧化应激系统来完成的，所以测定了mda、sod、cat、gsh等氧化应激相关指标，探究外源添加不同浓度的ca是如何影响香菇菌丝中cd胁迫产生的氧化应激。结果如图3所示。

丙二醛（mda）是香菇菌丝细胞膜脂过氧化反应的产物，其代表着细胞膜脂过氧化作用水平，因此可通过测定mda间接确定菌丝在镉逆境胁迫下过氧化损伤的程度。由图可知，cd处理组的mda含量高于ck组，说明低浓度镉也会对香菇菌丝造成氧化损伤，影响菌丝的生长繁殖；10mg/lca+cd、20mg/lca+cd和50mg/lca+cd三个处理组的mda含量均低于ck组和cd处理组，20mg/lca+cd处理组含量最低，说明在低镉胁迫下外源添加ca不仅可以促进菌丝对cd的吸附，而且能降低镉对菌丝造成的氧化损伤，修复香菇菌丝自身的氧化应激，且添加20mg/lca效果最好；70mg/lca+cd、100mg/lca+cd和150mg/lca+cd三个处理组的mda含量均显著高于其他处理组（p<0.05），说明虽然低镉胁迫下外源钙的添加可以降低镉对香菇菌丝产生的氧化损伤，促进菌丝生长，但是高浓度的钙也会对菌丝造成氧化损伤，；150mg/lca+cd处理组的mda含量与100mg/lca+cd处理组相比有所降低，推测可能原因是添加150mg/lca处理激活了其他信号分子。

超氧化物歧化酶（sod）是抵御活性氧的第一步防线，它可以催化超氧离子（o^2-）歧化生成h2o2和o2，保护细胞免受损伤。低镉胁迫下不同浓度钙处理对香菇菌丝体内sod酶活性的影响见图2-4。与ck组相比，cd处理组的sod活性显著降低（p<0.05），说明2mg/l的cd消耗了香菇菌丝自身的sod，但是镉对菌丝产生的毒害还不足以诱导sod活性的增加；低浓度ca+cd处理组与cd处理组相比sod活性升高，是因为低镉胁迫下外源添加ca缓解了cd的毒性，sod消耗较少；高浓度ca+cd处理组sod活性较高，和mda变化规律一致，说明高浓度的钙虽然缓解了镉对菌丝的毒性，但是钙诱导了超氧化物歧化酶活性。

过氧化氢酶（cat）是生物体防御系统的关键酶，是氧化应激代谢的主要成分。由图可知，部分h2o2被cat清除，cat活性降低，因为cat与h2o2亲和力较低，因此只能去除高浓度的h2o2；所以低镉胁迫下外源添加高浓度的钙使cat活性降低。

谷胱甘肽是抗cd毒性的第一道防线，可以直接和金属结合，使细胞免于受到金属诱导的氧化损伤。由图可知，镉处理后gsh含量降低，是由于cd与gsh反应形成谷胱甘肽-金属络合物，从而转运到液泡解毒。低镉胁迫下外源添加钙后香菇菌丝中gsh含量升高，表明ca对cd诱导的氧化应激的缓解作用与促进gsh生物合成有关，这与tianshengke等人的研究是一致的。

综上所述，低镉胁迫下外源钙的添加增强了香菇菌丝中sod、cat、gsh的活性，10~50mg/lca处理显著降低了mda的含量。

④、低镉胁迫下钙对香菇菌丝微观结构的影响

镉对香菇菌丝有一定毒害，相对正常菌丝其生物大分子构象会发生一定改变，因此通过扫描电镜观察低镉胁迫下外源钙对菌丝表面形态的影响。结果见图5。

ck组香菇菌丝表面较多突起；cd处理组菌丝之间发生粘连，可能是菌丝表面突起之间发生粘连，说明低镉胁迫可能导致细胞壁组分发生变化，从而使香菇菌丝表面形态发生改变；20mg/lca+cd处理组的菌丝之间没有发生粘连，但菌丝表面突起减少，说明2mg/lcd处理下外源添加20mg/lca处理修复了镉对菌丝产生的毒害，从而促进香菇菌丝吸收更多的镉；50mg/lca+cd处理组的菌丝部分发生粘连，菌丝表面突起减少。这与香菇菌丝的生长状况相对应。这可能是由于香菇菌丝通过改变细胞形态增加其抗性，在镉胁迫下，细胞壁组分和可溶性组分起重要的保护作用，这两种组分的变化引起细胞形态变化属于菌丝对环境胁迫下的一种应答反应。

实施例2

取样香菇菌株215品种，在麦芽浸粉液体培养基中添加2mg/l的氯化镉和10mg/l的氯化钙，用麦芽浸粉液体培养基、只添加氯化镉的麦芽浸粉培养基为对照，培养20天，用微波消解-电感耦合等离子体质谱法等测定香菇菌丝中镉含量，结果见图6。

从图6可以看出，与不含镉的普通培养基（麦芽浸粉培养基）中正常状态的菌丝（图6a）相比，添加镉后香菇菌丝球大，但量少（图6b），这说明镉会毒害香菇菌丝，影响香菇菌丝正常生长。在添加镉后再添加氯化钙，菌丝生长恢复正常状态，甚至长得更好（图6c），这说明氯化钙的添加大幅减少镉对香菇的毒害，能恢复香菇生命力，甚至还能促进香菇生长，从而促进镉的吸收。

表12mg/l镉胁迫下，添加10mg/l的氯化钙对215菌株菌丝中镉浓度的影响

注：麦芽浸粉：麦芽浸粉培养基中；cd：麦芽浸粉培养基+2mg/l氯化镉；cd+10ca：麦芽浸粉培养基+2mg/l氯化镉+10mg/l氯化钙。

从表1可以看出，与不含镉的普通培养基（麦芽浸粉培养基）中正常状态的菌丝相比，添加镉后香菇菌丝中镉浓度显著提高，这说明香菇对环境中的镉非常敏感，能快速富集环境中的镉。在添加镉后再添加氯化钙，菌丝中镉浓度进一步显著提高，提高6.84倍，这说明氯化钙的添加可以显著增加香菇对镉的富集能力。

实施例3

取样香菇菌株215品种，在麦芽浸粉液体培养基中添加2mg/l的氯化镉和50mg/l的氯化钙，用麦芽浸粉液体培养基、只添加氯化镉的麦芽浸粉培养基为对照，培养20天，用微波消解-电感耦合等离子体质谱法等测定香菇菌丝中镉含量，结果见图7。

从图7可以看出，与不含镉的普通培养基（麦芽浸粉培养基）中正常状态的菌丝（图7a）相比，添加镉后香菇菌丝球大，但量少（图7b），这说明镉会毒害香菇菌丝，影响香菇菌丝正常生长。在添加镉后再添加氯化钙，菌丝生长恢复正常状态，甚至明显长得更好（图7c），这说明氯化钙的添加大幅减少镉对香菇的毒害，能恢复香菇生命力，甚至还能大幅促进香菇生长，从而显著促进镉的吸收。

表22mg/l镉胁迫下，添加50mg/l的氯化钙对215菌株菌丝中镉浓度的影响

注：麦芽浸粉：麦芽浸粉培养基中；cd：麦芽浸粉培养基+2mg/l氯化镉；cd+50ca：麦芽浸粉培养基+2mg/l氯化镉+50mg/l氯化钙

从表2可以看出，与不含镉的普通培养基（麦芽浸粉培养基）中正常状态的菌丝相比，添加镉后香菇菌丝中镉浓度显著提高，这说明香菇对环境中的镉非常敏感，能快速富集环境中的镉。在添加镉后再添加氯化钙，菌丝中镉浓度进一步显著提高，提高6.84倍，这说明氯化钙的添加可以显著增加香菇对镉的富集能力。

对比例

2mg/l镉胁迫下，添加不同浓度的氯化钙对215菌株菌丝中丙二醛的影响

镉能引起菌丝体内氧化胁迫。丙二醛是脂质过氧化反应的终产物，能引起蛋白质、核酸等大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，引起细胞损伤。因此，丙二醛浓度与细胞过氧化损伤程度成正比，是衡量氧化胁迫程度的最常用指标。

取样香菇菌株215品种，在麦芽浸粉液体培养基中添加2mg/l的氯化镉，再在培养基中分别添加10mg/l的氯化钙和50mg/l的氯化钙，用麦芽浸粉液体培养基、只添加氯化镉的麦芽浸粉培养基为对照，培养20天，测定香菇菌丝中丙二醛含量。

从表3可以看出，与不含镉的普通培养基（麦芽浸粉培养基）中正常状态的菌丝相比，添加镉后香菇菌丝中丙二醛浓度升高，这说明镉会提高菌丝体内脂质过氧化水平，增加细胞损伤程度。在添加镉后再添加氯化钙，丙二醛浓度恢复正常状态，甚至更低。这说明氯化钙的添加不仅可以减少镉对香菇产生的负面影响，还能修复香菇自身的氧化应激，从而增强香菇生命力。

表32mg/l镉胁迫下，添加不同浓度的氯化钙对215菌株菌丝中丙二醛浓度的影响

注：麦芽浸粉：麦芽浸粉培养基中；cd：麦芽浸粉培养基+2mg/l氯化镉；cd+10ca：麦芽浸粉培养基+2mg/l氯化镉+10mg/l氯化钙；cd+50ca：麦芽浸粉培养基+2mg/l氯化镉+50mg/l氯化钙。

先将活化的10ml真菌菌丝接种于3kg原基诱导培养基中培养，获得菌棒，将原基形成后的菌棒平铺成15cm移入含镉土壤表面，再在菌棒表面喷洒150ml10-320mg/l的氯化钙溶液[请补充详细的修复镉污染土壤的操作步骤，及所用的真菌菌丝和氯化钙溶液的用量，以1平方米土地计。然后进行出菇管理。

取污染土壤10kg,将活化的10ml香菇菌株215品种菌丝接种于3kg原基诱导培养基中培养，获得菌棒，将原基形成后的菌棒平铺成15cm移入含镉土壤表面，再在菌棒表面喷洒150ml10mg/l的氯化钙溶液和50mg/l的氯化钙，用污染土壤为对照，出菇后，测定土壤中镉含量。

表4不同处理的土壤中的镉含量

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。