一种固定化金属离子亲和色谱材料及其制备和应用的制作方法

本发明属于功能性生物材料及其制备和在蛋白质特异性捕获、释放及纯化中的应用，具体的说是一种新型的表面涂层改性的固定化金属离子亲和色谱材料制备及其作为亲和纯化材料用于组氨酸标签蛋白的特异性捕获、释放及纯化。

背景技术：

重组蛋白技术在蛋白质结晶、蛋白质药物、蛋白质相互作用及结构蛋白质组学研究中具有非常重要的作用(T.Hyeon,et al.Adv.Mater.,2010,22,57–60；A.S.Robinson,et al.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。从蛋白质结构功能的研究到功能性蛋白质表达与纯化工艺的开发，亲和标签已经成为重组蛋白纯化中的一个非常重要且有效的工具。由于组氨酸标签具有标签短小、低免疫原性、不影响蛋白构象及功能、表达暴露于蛋白表面、亲和力强、易于纯化等优点，是目前重组蛋白纯化中使用最广泛亲和标签(A.S.Robinson,et al.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。

对组氨酸标签蛋白的纯化，目前常采用固定化金属离子亲和色谱(IMAC)技术，即通过IMAC材料上的金属离子与组氨酸标签之间的螯合作用实现组氨酸标签蛋白的捕获，随后利用竞争性螯合试剂或低pH洗脱液洗脱，使组氨酸标签蛋白特异性洗脱，实现其纯化。然而，由于IMAC材料上金属离子暴露在材料表面，任何能与金属离子产生螯合作用的蛋白质均被捕获在IMAC上，如表面富含组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸的蛋白质。同时，含有金属离子的蛋白质也可被IMAC捕获(A.S.Robinson,et al.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。这些蛋白质的吸附会导致组氨酸标签纯化纯度大幅降低，为达到所需纯度必须进行后期的二次甚至三次纯化(J.K.Shea,et al.J.Am.Chem.Soc.,2014,136,1194-1197)，纯化步骤越多，纯化效率越低，纯化成本也会大幅增加。因此，开发一步法高纯度纯化组氨酸标签蛋白的新型固定化金属离子亲和色谱材料意义重大。

对材料表面进行涂层改性，可以利用所包覆涂层的特性对基质材料的吸附行为进行调节。通过在IMAC材料表面包覆聚合物涂层，能在IMAC材料的金属螯合位点周围形成聚合物网络，利用聚合物网络的孔隙筛分作用，能使小分子、肽段及裸露在外的自由度较高的蛋白质末端进入聚合物网络进而被IMAC上金属离子所捕获；而由于空间位阻作用，其他体积较大的大分子蛋白质很难进入位点。通过这种表面涂层的孔隙筛分作用，IMAC材料能实现对特定目标物的特异性捕获及纯化。

因此，我们以IMAC材料作为基质材料，通过自由基聚合反应在IMAC 基质材料表面包被了一层聚合物涂层。在聚合物网络的筛分作用下，组氨酸标签蛋白的末端裸露组氨酸标签可以进入聚合物网络被IMAC材料捕获，而其他蛋白质缺乏末端组氨酸标签，同时完整蛋白空间阻力太大，无法进入聚合物网络。最终，利用表面涂层改性的IMAC材料实现了组氨酸标签蛋白的特异性捕获、释放及纯化。

技术实现要素：

选择表面固载了金属离子的基质材料，通过功能单体聚合形成表面包被的聚合物涂层，制备得到表面涂层改性的IMAC材料，并且将该材料用于组氨酸标签蛋白的特异性捕获、释放及纯化中。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

(1)在基质材料表面通过化学修饰引入功能单体聚合反应的反应位点，如氨基、巯基、羧基、碳碳双键、环氧基团等。

(2)在基质材料表面引入金属螯合配基，螯合基团包括亚氨基二乙酸基团(IDA)、次氨基三乙酸基团(NTA)、二甲基吡啶胺基团(DPA)、磷酸化丝氨酸基团(OPS)，三(2-胺乙基)胺基团、多巴胺基团、磷酸基团，利用金属螯合配基与金属离子的螯合作用，将金属离子(包括Cu²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，Fe²⁺，Ca²⁺，Co²⁺，Fe³⁺，Al³⁺，Yb³⁺，Ga³⁺等)固载于基质材料表面，制备得到IMAC材料(Chem Commun.2011；47:3969-71)。

(3)在室温条件下，将上述基质材料、功能单体及致孔剂分散于聚合溶剂中，加入引发剂，搅拌情况下进行聚合；功能单体包括丙烯酰胺类、硅氧烷类、多巴胺、乙烯基类、丙烯基类、苯乙烯基类等；聚合溶剂包括甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基甲酰胺(NMP)、水及上述溶剂以任意比例混合所得的混合溶剂；致孔剂包括聚合溶剂、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚环氧乙烯醚-聚环氧丙烯醚-聚环氧乙烯醚三嵌段共聚物(P123)、聚乙二醇-环氧乙烷加聚物(F127)、氨基酸、肽段、蛋白质等。反应结束后，离心收集材料，洗涤除去未完全反应的单体，即可制备得到表面涂层化修饰的金属离子亲和色谱材料(surface coated immobilized metal ion affinity chromatograph,SC-IMAC)。

(5)将该新型SC-IMAC材料用于生物分析、生物化工、生物技术领域内组氨酸标签蛋白的特异性捕获、释放及纯化。

本发明具有如下优点：

(1)本发明以IMAC材料为基质，利用表面涂层改性调节了IMAC材料对不同蛋白质的亲和性。通过表面涂层的孔隙筛分作用，在不影响组氨酸标签蛋白在IMAC上吸附的情况下，降低了杂蛋白的非特异性吸附，实现了组氨酸标签蛋白的特异性捕获、释放及纯化。

(2)本发明中IMAC材料外包被一层聚合物涂层，这会阻碍IMAC材 料上金属离子向外扩散，降低了金属离子泄露的可能。

(3)本发明基质材料、金属螯合臂、金属离子以及表面涂层都具有很好的稳定性，因此所制备得到的材料可以重复利用。

附图说明

图1：基于NTA及Ni²⁺螯合作用的二氧化硅IMAC表面涂层材料(SC-IMAC1)透射电镜表征图；

图2：SC-IMAC1纯化效果图；其中，泳道1：Marker，泳道2：重组蛋白表达液，泳道3：IMAC材料纯化组份，泳道4，SC-IMAC1纯化组份。

图3：基于IDA及Ni²⁺螯合作用的磁性IMAC表面涂层材料(SC-IMAC2)透射电镜表征图；

图4：SC-IMAC2纯化效果图，其中，泳道2：重组蛋白表达液，泳道3：SC-IMAC2材料纯化组份。

具体实施方式

实施例1

基于NTA及Ni²⁺螯合作用的二氧化硅IMAC表面涂层材料(SC-IMAC1)的制备

3g氨基修饰的二氧化硅纳米颗粒(粒径350nm)，分散于60mL PB缓冲液中，加入2mL戊二醛，室温下反应6h，水洗两次除去未反应的戊二醛。重悬材料与90mL PB缓冲液，加入200mg NTA，调节pH至8.0，室温下过夜反应，水洗两次去除未反应的NTA。将所得材料分散于30mL 10mg/mL的NiSO₄水溶液中，得到表面固载了Ni²⁺的IMAC材料。随后将100mg颗粒重新分散于20mL乙腈中，加入10mg丙烯酰胺(AAm)，10mg亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，0.5mg AIBN，通N₂20min后，65℃磁力搅拌反应12h，离心收集获得产物，超纯水清洗3次，真空干燥，得到基于NTA及Ni²⁺螯合作用的二氧化硅IMAC表面涂层材料(SC-IMAC1)。

用相同的方法，在基质材料上只固载金属离子，不进行后续表面涂层改性，制备得到传统IMAC材料。

如图1，所制得SC-IMAC1大小均匀、分散性好，粒径300-400nm，测得孔隙率为10％。同时，表面很薄的聚合涂层保证了组氨酸标签可通过涂层接近螯合位点，同时其他完整蛋白难以进入涂层。

实施例2

基于NTA及Ni²⁺螯合作用的二氧化硅IMAC表面涂层材料(SC-IMAC1)用于组氨酸标签蛋白的纯化

4mg SC-IMAC用80μL含10mM咪唑的上样缓冲液于4℃下清洗两次，使SC-IMAC1处于上样环境。将重组蛋白提取液用上样缓冲液稀释至4mg/mL，加200μL于预平衡的SC-IMAC1中，4℃下振荡孵育30min。离心收集材料，100μL上样缓冲液洗涤一次，去除未结合蛋白。30μL含25mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤2次，30min/次，以去除弱结合的杂蛋白。 30μL含250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱4次，30min/次，洗脱组氨酸标签蛋白，SDS-PAGE分析纯化产物。

作为参照组，在相同的操作条件下，用IMAC作为亲和纯化材料对组氨酸标签蛋白进行纯化，SDS-PAGE分析。

如图2，由于SC-IMAC1表面进行了涂层改性，阻碍干扰蛋白接近螯合位点，降低了非特异性吸附，而由于组氨酸标签裸露在外而且比完整蛋白小，可以通过涂层中的聚合物网络进而靠近螯合位点被捕获，因此纯度有了很大提高，达到84％(泳道4)；然而对IMAC而言，金属螯合位点裸露在外，因此可大量捕获目标蛋白组氨酸标签蛋白，但是同时也吸附了大量的干扰蛋白，纯度仅67％(泳道3)。

实施例3

基于IDA及Ni²⁺螯合作用的磁性IMAC表面涂层材料(SC-IMAC2)的制备

5g二氧化硅纳米颗粒加入100mL GLYMO-IDA溶液中，65℃下反应24小时，将IDA基团修饰于二氧化硅材料表面。将5g上述材料加入150mL甲醇中，随后加入10mLγ-MAPS，于90℃下回流15小时，然后通过甲醇回流的方法，在该基质材料表面修饰γ-MAPS。同实施例1方法，可制得基于IDA及Ni²⁺螯合作用的磁性IMAC表面涂层材料(SC-IMAC2)，如图3所示。同实施例2，用SC-IMAC2纯化组氨酸标签蛋白，纯化结果如图4所示。

实施例4

基于多巴胺单体的二氧化硅IMAC表面涂层材料(SC-IMAC3)的制备

同实施例1，制备表面修饰NTA及γ-MAPS的基质材料。以多巴胺为功能单体进行在其表面进行聚合，形成表面聚合物网络，可制备得到基于多巴胺单体的二氧化硅IMAC表面涂层材料(SC-IMAC3)。

实施例5

基于NIPAAm单体的二氧化硅IMAC表面涂层材料(SC-IMAC4)的制备

同实施例1，制备表面修饰NTA及γ-MAPS的基质材料。以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)为功能单体进行表面聚合，可制备得到基于NIPAAm单体的二氧化硅IMAC表面涂层材料(SC-IMAC4)。

实施例6

同实施例1及实施例3，用CoSO₄处理表面固载有IDA或NTA的基质材料，可将Co²⁺螯合在该材料表面，随后进行表面聚合物包被，可制备得到基于Co²⁺螯合的IMAC表面涂层材料(SC-IMAC5)。