工程芯片、制备方法及应用与流程

本发明涉及生物器械领域，具体涉及一种工程芯片及其制备方法及其应用。

背景技术：

基因测序仪所要检测的对象属于分子级别，因此，其对光学系统的精准度要求非常高，在检测基因序列之前必须先对光学系统进行调试和校准。

例如，调试自动对焦系统的准确性、滤光片的可靠性、光学平台的稳定性等要素。在现有技术中，使用的方法包括将荧光材料和胶体混合后注入到测序芯片中，使其凝固在测序芯片内，然后使用该凝固有荧光材料的测序芯片对光学系统进行调试。该方法存在荧光材料和胶体混合后呈无规则的方式分布，其均匀性和一致性无法保证的问题。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出一种工程芯片及其制备方法及工程芯片在调试和/或校准基因测序仪光学系统中的用途及将带有荧光基团的材料加载到工程芯片上的方法。

本发明实施方式的工程芯片包括基板，所述基板上具有一个或者多个连接区域，每个所述连接区域形成有氨基化层，所述氨基化层具有一个或多个氨基层，每个所述氨基层具有多个氨基，每个所述连接区域能够通过所述一个或多个氨基层连接带有羧基的物质。

本发明实施方式的工程芯片能够通过一个或多个氨基层连接带有羧基的物质，因此带有羧基的物质能够较为稳固地分布于连接区域上。同时，由于连接区域中的氨基层具有多个氨基，如此，可以通过多个氨基对应与携带有多个羧基的体积较大的带有羧基的物质进行连接。因此，扩大了可连接的带有羧基的物质的范围，从而扩大了工程芯片的应用范围。

在某些实施方式中，所述连接区域呈圆形、椭圆形和多边形中的至少一种形状。

在某些实施方式中，所述连接区域呈方形，所述连接区域的边长的范围为200-240nm。

在某些实施方式中，所述基板上具有多个连接区域，所述多个连接区域间隔地设置 于所述基板上。

在某些实施方式中，所述基板上具有钝化区域，所述钝化区域与所述连接区域连接。

在某些实施方式中，所述钝化区域是通过化学试剂处理所述基板上的所述连接区域外的区域而形成的，所述化学试剂为六甲基二硅氮烷(hmds)。

在某些实施方式中，所述基板上具有多个凹槽，每个所述凹槽的底面上具有所述一个或多个连接区域。

在某些实施方式中，所述工程芯片包括盖板，所述盖板可拆卸连接于所述基板上，所述盖板上设有多个输入口和多个输出口一一对应，所述输入口与所述输出口与所述凹槽连通。

在某些实施方式中，所述多个凹槽间隔并对称地设置于所述基板上。

在某些实施方式中，所述基板为硅基板。

在某些实施方式中，所述带羧基的物质为带有荧光基团的材料。

在某些实施方式中，所述工程芯片还包括所述带有羧基的物质，所述带有羧基的物质通过所述一个或多个氨基层与所述连接区域连接。

本发明实施方式的上述所述的工程芯片在调试和/或校准基因测序仪光学系统中的用途。

本发明实施方式的所述的工程芯片的制备方法，包括如下步骤：

将所述基板进行掩膜光刻，以形成一个或者多个第一区域；

将所述第一区域进行氨基化处理，以获得所述连接区域。

本发明实施方式中的上述所述工程芯片的制备方法通过掩膜光刻在基板上形成一个或者多个第一区域，将所述第一区域进行氨基化处理，以获得所述连接区域，如此得到上述所述工程芯片。

在某些实施方式中，所述工程芯片的制备方法还包括利用化学试剂清除所述基板的第二区域的羟基，以获得所述钝化区域，所述钝化区域与所述连接区域连接。

在某些实施方式中，通过化学气相沉积方法(cvd)进行所述氨基化处理。

在某些实施方式中，利用所述化学气相沉积方法(cvd)进行所述氨基化处理使用的物质为3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)。

本发明实施方式的将带有荧光基团的材料加载到上述所述的工程芯片上的方法，包括如下步骤：

将含有缩合剂的溶液和所述带有荧光基团的材料进行混合，得到混合试剂；

将所述混合试剂注入到所述工程芯片的基板上进行孵育，

以将所述带有荧光基团的材料加载到所述工程芯片上。

本发明实施方式的将带有荧光基团的材料加载到上述所述工程芯片上的方法能够通过利用氨基与羧基的缩合反应而将带有荧光基团的材料加载于上述所述的工程芯片上，如此，可以将该工程芯片应用于基因测序仪的光学系统的调试和校准中。

在某些实施方式中，所述带有荧光基团的材料为荧光小球，所述荧光小球的直径为200nm。

在某些实施方式中，所述荧光小球包括第一荧光小球和第二荧光小球，所述第一荧光小球的激发光/发射光的波长为540/560，所述第二荧光小球的激发光/发射光的波长为660/680。

在某些实施方式中，所述缩合剂为2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)。

在某些实施方式中，所述含有缩合剂的溶液包括二异丙基乙基胺。

在某些实施方式中，所述2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)与所述二异丙基乙基胺的摩尔浓度比为1:1。

在某些实施方式中，还包括对孵育后的工程芯片进行清洗的步骤。

在某些实施方式中，所述清洗选自离心震荡清洗、超声清洗和利用磷酸盐(pbs)缓冲液清洗中的至少一种。

本发明实施方式的将荧光基团的材料加载到上述所述工程芯片上的方法能够通过利用氨基与羧基的缩合反应而将带有荧光基团的材料加载于上述所述的工程芯片上，如此，可以将该工程芯片应用于基因测序仪的光学系统的调试和校准中。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明实施方式的工程芯片表面的局部微观放大图。

图2是图1的工程芯片的连接区域的平面结构示意图。

图3是本发明实施方式的工程芯片沿a-a线的剖面示意图。

图4是图3的工程芯片的ⅰ放大结构示意图。

图5是本发明实施方式的工程芯片的立体结构示意图。

图6是本发明实施方式的工程芯片的制备方法的流程示意图。

图7是本发明实施方式的无水条件下的3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)与 羟基(-oh)的反应化学式。

图8是本发明实施方式的有水条件下的3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)与羟基(-oh)的反应化学式。

图9是本发明实施方式的将带有荧光基因的材料加载到工程芯片上的方法的流程示意图。

图10是本发明实施方式的将带有荧光基因的材料与连接区域上的氨基进行缩合反应的反应原理示意图。

图11是本发明实施方式的两种荧光小球在基因测序仪的光学系统中的拍照结果对比图。

图12是本发明实施方式的两种荧光小球在基因测序仪的光学系统中的拍照结果合成图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。附图中相同或类似的标号自始至终表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。

另外，下面结合附图描述的本发明的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明的实施方式，而不能理解为对本发明的限制。

请参图1～图4，本发明实施方式的工程芯片100包括基板10。基板10上形成有一个或者多个连接区域11。每个连接区域11形成有氨基化层12。氨基化层12具有一个或多个氨基层121。每个氨基层121具有多个氨基a。每个连接区域11能够通过一个或多个氨基层121连接带有羧基的物质b。

本发明实施方式的工程芯片100能够通过一个或多个氨基层121连接带有羧基的物质b，因此带有羧基的物质b能够较为稳固地分布于连接区域11上。同时，由于连接区域11中的氨基层121具有多个氨基a，如此，可以通过多个氨基a对应与携带有多个羧基(-cooh)的体积较大的带有羧基的物质b进行连接。因此，扩大了可连接的带有羧基的物质b的范围，从而扩大了工程芯片100的应用范围。

本实施方式中，工程芯片100能够通过一个或多个氨基层121的氨基a与带有羧基的物质b进行缩合反应而连接，如此，通过化学反应使带有羧基的物质b与氨基a形成化学键而连接。

氨基(-nh2)和羧基(-cooh)的缩合反应常见于有机物的化学反应中。一方面，很多有机物中本身结构中具有羧基(-cooh)和氨基(-nh2)的基团，例如氨基酸同时带有氨基(-nh2)和羧基(-cooh)，氨基酸能够通过自身的一个氨基和一个羧基脱水 缩合并形成环状的酰胺。另一方面，即使有机物中本身结构中无羧基(-cooh)和氨基a的基团，也可以通过化学修饰使其氨基化或者羧基化，例如，基因测序中所用的荧光染料cy5等通过制备合成使其具有羧基。

同时，无机化合物也可以通过化学修饰使无机化合物的表面氨基化或者羧基化。例如可以通过先将碳纳米材料表面氧化形成羟基，然后利用偶联剂偶联氨基酸或者有机胺从而在碳纳米材料表面连接上氨基。同样，可以通过利用混合酸处理碳纳米材料而使碳纳米材料表面羧基化。

本实施方式中，氨基化层12具有一个氨基层121。在其他实施方式中，氨基化层12可以包括多个氨基层121。因此，需要说明的是，并不仅仅限于本实施方式中的一个氨基层121。

本实施方式中，氨基层121为由多个氨基a分布于同一水平位置而形成的。如此，带有羧基的物质b能够通过缩合反应与氨基层121的氨基a连接而稳定且均匀地分布于连接区域11上。

本实施方式中，带有羧基的物质b可以为带有荧光基团的材料。具体地，所述带有荧光基团的材料先通过化学修饰使表面羧基化，然后将所述带有荧光基团的材料与工程芯片100上的氨基化层12上的氨基a通过缩合反应连接。将所述带有荧光基团的材料的表面进行羧基化所采用的技术为现有技术，在此不再具体说明。

如此，所述带有荧光基团的材料能够均匀且稳定地分布于工程芯片100上，从而能够将其应用于基因测序仪的光学系统的调试和校准中，同时由于所述带有荧光基团的材料分布均匀且结合稳定，加载有所述带有荧光基团的材料的工程芯片利于基因测序仪的光学系统的调试和校准，从而提高了调试和校准的准确性。

例如，所述带有荧光基团的材料可以为带有荧光基团的基因分子，如此，可以将带有荧光基团的基因分子连接于工程芯片100上，然后直接应用于基因测序仪的光学系统的调试和校准中。

在其他实施方式中，带有羧基的物质b可以为羧基化的生物素、羧基化的抗体等合适的生物体。例如，可以将羧基化的生物素、羧基化的抗体等合适的生物体加载到工程芯片100上，并可以通过将羧基化的生物素、羧基化的抗体等合适的生物体加载到工程芯片100上，从而与其他生物体中分离出来，从而可以将带有将羧基化的生物素、羧基化的抗体等合适的生物体的工程芯片100进行显微观察。如此，由于羧基化的生物素、羧基化的抗体等合适的生物体能够均匀且稳定地分布于工程芯片100上，从而利于进行显微观察，便于识别。

在又一其他实施方式中，带有羧基的物质b可以为脱氧核糖核苷三磷酸(dntp) 等合适的自身带有羧基的生物体。例如，在脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)的制备过程中，可以通过中间连接体linker(如2-氨基乙酸)与荧光染料dye连接，然后再将带有荧光染料dye的脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)与工程芯片100通过氨基a与脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)中的羧基(-cooh)缩合连接。

因此，需要说明的是，带有羧基的物质b并不仅仅限于本实施方式中的带有荧光基团的材料。

本实施方式中，所述带有荧光基团的材料可以为荧光小球。荧光小球的使用寿命长，利于基因测序仪的光学系统的调试和校准，从而能够提高调试和校准的准确性。

在现有技术中，对基因测序仪的光学系统的调试和校准的使用的方法还包括直接使用加载有基因分子的测序芯片来进行调试，其中基因分子携带有荧光标记。该方法存在的缺陷是荧光标记在长时间照射下会逐渐淬灭，无法满足光学系统长时间的调试和校准，同时，这种方法需要耗费不少试剂，而且该方法制作的测序芯片是一次性的，不能重复应用，调试成本高且操作繁琐。

本实施方式中，由于连接区域11中的氨基层121具有多个氨基a，如此，可以通过多个氨基a对应与携带有多个羧基(-cooh)的体积较大的带有荧光基团的材料通过缩合反应而连接。因此，增大了可连接的带有荧光基团的材料的范围，从而可以选择寿命较长的、体积较大的带有荧光基团的材料连接于工程芯片100上。例如，本实施方式中，可以选择寿命较长的荧光小球与工程芯片100进行连接，具体地，可以选择直径为200nm的荧光小球，从而可以有效解决现有技术中存在的基因分子携带的荧光标记使用寿命短，不能重复使用的问题。

可以理解，在其他实施方式中，所述带有荧光基团的材料可以是羧基化的量子点材料。加载有羧基化的量子点材料的工程芯片100也可以应用于光学系统的调试中。因此需要说明的是，所述带有荧光基团的材料并不仅仅限于本实施方式中的荧光小球。

本实施方式中，多个连接区域11间隔并对称地设置于基板10上。

如此，避免了多个连接区域11之间相互影响，并利于带有羧基的物质b在工程芯片100上进行分布，从而提高工程芯片100的精确度。

本实施方式中，连接区域11的面积范围可以为50-100000nm²。连接区域11的面积范围可以根据具体情况进行设置。

本实施方式中，连接区域11呈方形。连接区域11的长度范围为200-240nm。在其他实施方式中，连接区域11可以呈圆形或者椭圆形或者其他合适的多边形，因此，需要说明的是，并不仅仅限于本实施方式中的方形。

本实施方式中，所述荧光小球的直径为200nm。如此，所述荧光小球的直径大小与 连接区域11的长度范围(200-240nm)相匹配，确保每个荧光小球占据一个连接区域11，从而防止荧光小球的堆叠，利于光学系统的识别。

本实施方式中，基板10上具有钝化区域13。钝化区域13与连接区域11连接。

钝化区域13为化学试剂c(见图1)进行化学处理过的区域，目的是防止钝化区域13对连接区域11产生影响，例如，当钝化区域13存在羟基(-oh)时，羟基(-oh)可能会与带有羧基的物质b通过化学反应而连接，如此影响带有羧基的物质b的分布。因此，设置钝化区域13利于带有羧基的物质b的在工程芯片100上的分布。

本实施方式中，钝化区域13是通过化学试剂c处理基板10上的连接区域11外的区域而形成的。化学试剂c为六甲基二硅氮烷(hmds，或称“六甲基二硅胺”)。

如此，避免基板10上的钝化区域13附着上带有羧基的物质b，从而影响工程芯片100的准确性。

本实施方式中，基板10可以为硅基板或者玻璃片等，由于基板10的材料特性，使得基板10具有亲水性，基板10暴露于含h2o空气中而易于被氧化，使得基板10表面上带有羟基(-oh)。

具体地，本实施方式中，六甲基二硅氮烷(hmds)与钝化区域13上的羟基(-oh)进行反应，从而消耗掉钝化区域13上的羟基(-oh)，从而使得钝化区域13带有多个三甲基硅基团d，由于三甲基硅基团d不与羧基(-cooh)进行缩合反应，从而避免了钝化区域13上的所述羟基(-oh)对工程芯片100的影响。

请参阅图5，本实施方式中，基板10上形成有多个凹槽14。每个凹槽14的底面141上设置有一个或多个连接区域11，通常设有数以十亿计的连接区域11，图1为凹槽底面141的微观放大示意图。

如此，便于带有羧基的物质b以流体形式流经并均匀地分布于每个连接区域11上，并与连接区域11上的氨基a进行缩合反应。

本实施方式中，凹槽14的数目可以根据具体情况进行设置。

本实施方式中，工程芯片100包括盖板20。盖板20可拆卸连接于基板10上。盖板20上设有一个或者更多的输入口21和输出口22。输入口21和输出口22一一对应。输入口21和输出口22与凹槽14连通。

本实施方式中，盖板20设置于基板10上，并且使得每个凹槽14形成封闭的流道。盖板20开设有多个输入口21和多个输出口22，输入口21和输出口22与流道对应。带有羧基的物质b可通过输入口21进入基板10的凹槽14内并且由输出口22流出。

如此，带有羧基的物质b可以以流体形式由盖板20上的输入口21进入基板10的凹槽14内并可由输出口22流出，利于带有羧基的物质b均匀地分布于每个连接区域11 上并进行充分反应。

本实施方式中，输入口21和输出口22的数目可以根据具体情况进行设置。

本实施方式中，多个凹槽14间隔并对称地设置于基板10上。每个凹槽14相对地设置有一个输入口21及一个输出口22。

如此，利于带有羧基的物质b可以通过对应输入口21进入每个凹槽14并从对应的输出口22流出，如此，利于带有羧基的物质b的分布，并且方便工程芯片100的使用。

本实施方式中，基板10为硅基板。硅基板为常见的材料，易于制造，成本较低。

在其他实施方中，基板10可以为玻璃基板或金属基板等，因此，需要说明的是，基板10并不仅仅限于本实施方式中的硅基板。

在其他实施方式中，工程芯片100还可以直接包括带有羧基的物质b。带有羧基的物质b通过一个或多个氨基层121与连接区域11连接。

请参阅图6，本发明实施方式的所述工程芯片的制备方法，包括如下步骤：

s1、将所述基板进行掩膜光刻，以形成一个或者多个第一区域；

s2、将所述第一区域进行氨基化处理，以获得所述连接区域。

本发明实施方式中的上述所述工程芯片的制备方法通过掩膜光刻在基板上形成一个或者多个第一区域，将所述第一区域进行氨基化处理，以获得所述连接区域，如此得到上述所述工程芯片。

本实施方式中，所述工程芯片的制备方法还可以包括利用化学试剂清除所述基板的第二区域的羟基(-oh)，以获得所述钝化区域，所述钝化区域与所述连接区域连接。

如此，利用所述化学试剂清除所述基板上所述第二区域的羟基(-oh)，从而防止所述第二区域的羟基影响所述氨基化处理，避免所述第二区域带有氨基(-nh2)，从而影响工程芯片的使用。

本发明实施方式的步骤s1和s2能够制备出上述工程芯片100。

在步骤s1中，将基板10进行掩膜光刻并形成一个或者多个所述第一区域。所述第一区域形成点阵结构。

具体地，本实施方式中，所述第一区域呈方形，且所述第一区域的边长的范围为200-240nm。

在步骤s2中，将所述第一区域进行所述氨基化处理，以获得连接区域11。

本实施方式中，基板10还可以包括钝化区域13。钝化区域13可以通过将所述第一区域盖住，然后利用化学试剂c清除基板10上所述第二区域的羟基而形成。

具体地，本实施方式中，可以利用胶盖住所述第一区域，然后再利用化学试剂c对所述第二区域进行化学处理。所述胶通常为光刻胶。如此，形成钝化区域13。

本实施方式中，所述化学试剂可以为六甲基二硅氮烷(hmds)。六甲基二硅氮烷(hmds)与所述第二区域的羟基(-oh)进行化学反应形成钝化区域13。

本实施方式中，将连接区域11通过化学气相沉积方法(cvd)进行氨基化处理。

化学气相沉积是一种制备材料的气相生长方法，指通过把一种或几种含有构成薄膜元素的化合物、单质气体通入放置有基材的反应室，借助空间气相化学反应在基材表面上沉积固态薄膜的工艺技术。化学气相沉积法(cvd)为广泛用于提纯物质、研制新晶体、沉积各种单晶、多晶或玻璃态无机薄膜材料的新技术。借助空间气相化学反应在基体表面上沉积固态薄膜的工艺技术，化学气相沉积法(cvd)能够在较大的范围内较为精确地控制产物的组分，并可以较为精确地在基材上形成分布均匀的产物薄膜。

如此，可以通过化学气相沉积法(cvd)在连接区域11上形成一层较为均匀的氨基化层12。

本实施方式中，基板10为硅基板。硅基板表面带有羟基(-oh)。

具体地，本实施方式中，请参阅图8与图9，利用化学气相沉积法(cvd)进行氨基化处理使用的原料为3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms，化学式：c6h17no3si)。反应原理如图所示，3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)与羟基(-oh)反应而形成氨基化层121。图8为在无水条件下，3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)与羟基(-oh)的反应化学式。图9为有水条件下，3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)与羟基(-oh)的反应化学式。在有水条件下，3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)先进行水解，然后再与羟基(-oh)进行反应。

本实施方式中，3－氨基丙基－三甲氧基硅烷(aptms)为常用的物质，易于制造，成本较低。

请参阅图7，本发明实施方式的将带有荧光基团的材料加载到上述所述工程芯片上的方法，包括如下步骤：

s01、将含有缩合剂的溶液和所述带有荧光基团的材料进行混合，得到混合试剂；

s02、将所述混合试剂注入到所述工程芯片的基板上进行孵育，以将所述带有荧光基团的材料加载到所述工程芯片上。

本发明实施方式的将带有荧光基团的材料b1加载到上述所述工程芯片上的方法能够通过利用氨基与羧基的缩合反应而将带有荧光基团的材料加载于上述所述的工程芯片上，如此，可以将该工程芯片应用于基因测序仪的光学系统的调试和校准中。

本实施方式中，带有荧光基团的材料b1为荧光材料。在其他实施方式中，带有荧光基团的材料b1可以为带有荧光基团的基因分子等合适的带有荧光基团的材料b1。因此，需要说明的是，并不仅仅限于本实施方式中的荧光材料。

本实施方式中，可以通过先将所述荧光材料表面羧基化，以使所述荧光材料带有羧基。将所述荧光材料羧基化为现有技术，在此不再具体说明。

请参阅图10，本实施方式中，将带有荧光基团的材料b1通过缩合反应而连接到所述工程芯片的反应原理如图所示，其中r1代表荧光基团，r2及r3为其他基团，比如甲基(-ch3)。将带有荧光基团的材料b1先通过羧基与缩合剂e反应生成中间产物f，并伴随有副产物生成，然后再由中间产物f与带有氨基的物质g进行缩合反应并形成物质k而连接。其中，缩合剂e用于活化带有羧基的物质b的羧基基团，如此，利于反应的进行。

本实施方式中，将所述混合试剂注入到所述工程芯片的基板上进行孵育的时间可以根据具体情况进行设置，例如可以为30min。

本实施方式中，可以通过对所述工程芯片进行离心震荡和超声清洗，并利用磷酸盐(pbs)缓冲液进行清洗，从而将物理吸附于所述工程芯片上多余的羧基化的荧光材料去除。

在其他实施方式中，可以通过将所述工程芯片的基板通过离心震荡清洗的方法、超声清洗的方法和利用磷酸盐(pbs)缓冲液清洗的方法中的至少一种方法进行清洗。

本实施方式中，离心震荡和超声清洗的时间以及次数可以根据具体情况进行设置，例如20min。利用磷酸盐(pbs)缓冲液进行清洗的次数根据具体情况进行设置，例如可以为3次。

本发明实施方式的步骤s01和s02能够将带有荧光基团的材料b1加载于上述工程芯片100中。

在步骤s01中，将含有缩合剂的溶液和带有羧基的带有荧光基团的材料b1进行混合配比得到混合试剂

具体地，本实施方式中，缩合剂为2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)。本实施方式中，所述含有缩合剂的溶液包括二异丙基乙基胺。二异丙基乙基胺用于与带有荧光基团的材料b1与2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)反应生成的副产物进行反应，从而消耗所述副产物而促进反应往正方向进行。

本实施方式中，2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)与二异丙基乙基胺的摩尔浓度比为1:1。如此，利于充分反应。

具体地，例如，本实施方式中，可以分别取10μm的2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)及二异丙基乙基胺用于反应中。

本实施方式中，带有荧光基团的材料b1为两种荧光小球，所述荧光小球包括第一荧光小球和第二荧光小球，所述第一荧光小球的激发光/发射光的波长为540/560，所述 第二荧光小球的激发光/发射光的波长为660/680。

本实施方式中，所述两种荧光小球为表面羧基化的荧光小球。

如此，通过采用两种荧光小球，即所述荧光小球包括第一荧光小球和第二荧光小球混合加载于在同工程芯片100上，从而可以同时用来调试和校准两种不同波长的光路系统，也可以对两种激光激发的荧光信号进行对比分析，两种荧光小球在工程芯片100的基板10上交叉均匀分布，从而可以用以检验自动对焦系统、激光和滤片的性能。

例如，请参阅图11，本实施方式中，通过采用两种荧光小球，在利用光学系统对工程芯片100进行拍照分析时，需要分别在光学系统的的两种不同的激发光模式(激光波长分别为532nm和660nm)下进行验证，如此，可以用于调试和校准具有两种波长激发光的光学系统。当将加载有两种荧光小球的工程芯片于光学系统中进行拍照实验时，由于工程芯片100的基板10存在连接区域11和钝化区域13，而连接区域11加载有荧光小球，而钝化区域13不包含荧光小球，因此，在光学系统中进行拍照得到的拍照图片将呈现出工程芯片100上荧光小球的疏密程度。

具体地，拍照结果如图所示：540/560nm荧光小球的浓度较高，因此在照片中表现的较密，工程芯片100的钝化区域13由于不包含荧光小球，在图片中以暗的网状线形式体现，且由于540/560nm荧光小球浓度较高，对比较为明显，能够较为清晰的体现出网状线的位置；660/680nm荧光小球的浓度较低，因此在照片中表现的较稀，不能较为清晰地体现出网状线的位置。如果将两种荧光小球芯片的拍照结果对比分析，通过图形拟合软件将照片拟合在一起，对比结果更清晰，如图12所示，荧光信号的疏密程度与荧光小球的浓度呈正相关。如此，通过不同种类的荧光小球进行光学系统的校准和调试。

具体地，本实施方式中，将所述混合试剂注入到工程芯片100的基板10上进行孵育的时间为30min。

本实施方式中，孵育完后，还需要对工程芯片100进行清洗，以将物理吸附于工程芯片100上的或者过量的荧光小球清除。

具体地，所述清洗至少可以选择离心震荡的方法、超声清洗的方法和利用磷酸盐(pbs)缓冲液进行清洗的方法中的一种。

例如，本实施方式中，通过对工程芯片100进行离心震荡和超声清洗，并利用磷酸盐(pbs)缓冲液进行清洗，从而将物理吸附于工程芯片100上的荧光小球去除。

本实施方式中，利用磷酸盐(pbs)缓冲液的浓度为50mm。该浓度的磷酸盐(pbs)缓冲液利于清洗。

以下为利用上述两种荧光小球加载于工程芯片100上对基因测序仪的光学系统进行调试和校准的具体示例，包括以下步骤：

1.分别配制浓度为10μm的2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)和10μm的二异丙基乙基胺溶液。

2.取激发光和发射光分别为540/560，660/680的两种荧光小球悬浮液放入混2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)中，然后加入二异丙基乙基胺溶液，孵育30min，使缩合反应充分进行。

3.利用负压泵装置将缩合反应后的的荧光小球悬浮液以60ul/s的速度泵入生物芯片流道中，孵育1个小时。

4.利用50mmpbs缓冲液冲洗芯片流道，除去多余的荧光小球。

5.对芯片进行离心震荡和适当超声清洗除去硅基表面非氨基化区域的荧光小球，而氨基化区域的荧光小球依然存在。

6.用50mmpbs冲洗芯片流道三次，并在荧光显微镜下观察并拍照。

如此，可以将两种不同的荧光小球(直径为200nm)通过氨基a与羧基(-cooh)的缩合反应而加载于工程芯片100上，且由于荧光小球为均匀且稳定地分布于每个连接区域11上，从而保证了使用该工程芯片100对基因测序仪的光学系统进行调试和校准的准确性。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第 一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。