铂‑磺化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶的制作方法

本发明涉及具有模拟过氧化物酶特性的铂-磺化石墨烯复合纳米材料，属于纳米技术和仿生技术领域。

背景技术：

天然酶主要是蛋白质，少量为核酸，是在维持生物的生命活动和化学反应等基本过程中发挥重要作用的物质。由于酶对底物结合的特异性及其高效的催化活性使得其在各个领域备受关注。然而，天然酶来源有限，提纯复杂困难，保存条件苛刻，操作过程中易受多种物理、化学环境影响导致变性失活等诸多弊端限制了天然酶的应用。具有天然酶相似功能的人工模拟酶恰恰能够克服天然酶上述的缺点，并且在热稳定性、制备成本、催化活性、生物检测等方面展现出巨大的优势。因此，人工模拟酶的研究开发与应用越来越多的受到人们的重视。

过氧化物酶一般是催化过氧化氢或其他过氧化物，表现为易对多种有机物或无机物产生氧化作用。在过氧化物酶研究中，研究最为广泛的是具有模拟过氧化物酶活性的碳纳米材料。由于碳纳米材料的低成本，易大规模生产，可长期存储以及在恶劣环境中保持高度稳定性等优点，使其被广泛应用于环境检测和生物医学等领域。目前，石墨烯、氧化石墨烯、碳纳米管、碳量子点、石墨烯量子点等均被报道具有过氧化物模拟酶活性，但相比于自然酶，这些碳材料的低催化性能限制了其应用。

纳米级别的铂粒子具有独特的物理和化学性质，被广泛地应用于生物传感器、光化学与电化学催化、半导体荧光探针、光电子器件等领域。近年来，研究者们致力研究铂纳米粒子稳定剂以克服其在溶液中的低分散性、易产生团聚沉降现象、电子传递途径易被部分阻断及表面活性位点易被掩盖等缺陷。现已报道的铂纳米粒子稳定剂有水溶性小分子化合物柠檬酸钠、烷基胺、乙二醇，水溶性聚合物聚乙烯吡咯烷酮、聚（酰胺-胺）、聚（丙烯酸），蛋白质类牛血清白蛋白、去铁铁蛋白、溶菌酶，碳材料碳纳米、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯等。用上述稳定剂制备的复合材料在一定程度上克服了铂纳米粒子本身存在的一些缺陷，但是其合成过程操作复杂、耗费试剂多且制备时间长，或降低了原本铂纳米粒子的催化活性。因此，寻求快速、简便的制备方法获得高稳定性、高活性的铂纳米材料具有重大意义。

本发明利用磺化石墨烯作为支撑载体，通过硼氢化钠还原合成的方法，制备磺化石墨烯-纳米铂复合材料，该复合材料对底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢（H₂O₂）同时具有高亲和力。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种以磺化石墨烯为基底，通过硼氢化钠还原法合成铂纳米粒子-磺化石墨烯复合材料，利用铂纳米粒子-磺化石墨烯复合材料的优良催化特性模拟过氧化物酶。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的铂-磺化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是铂-磺化石墨烯复合纳米材料具有过氧化物酶特性，催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色；所述的铂-磺化石墨烯复合纳米材料由以下方法制备的：往12.559 mL浓度为2.389 mg/mL的磺化石墨烯溶液中加入1.796 mL浓度7.9 mmol/L的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15分钟后，逐滴加入0.645 mL浓度为2.5 mg/mL硼氢化钠水溶液，搅拌4小时后即得铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，真空干燥后得到铂-磺化石墨烯复合纳米材料粉末。

所述磺化石墨烯的制备方法为：将Hummers法制备出的氧化石墨烯分散于去离子水中，超声处理3小时得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散体系，往氧化石墨烯分散体系加入5wt%碳酸钠溶液，使得体系pH值为9~10，然后加入30 mL浓度为 0.16 g/mL 硼氢化钠溶液，在80 ℃下搅拌反应1小时，8000转/分钟离心后用水洗涤沉淀，得到中性的还原氧化石墨烯，将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液75 mL，再将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液中并在冰浴条件下搅拌反应2小时，离心后用双蒸水洗涤沉淀至pH值为7，得到呈中性的耦合物，将上述所得的耦合物分散于150 mL去离子水中，加入10 mL浓度为1.6 g/mL水合肼，在100 ℃下搅拌24小时进行还原反应，然后滴加5 wt %碳酸钠溶液沉淀磺化石墨烯，将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在一定温度下进行真空干燥，得到磺化石墨烯固体，取119.45 mg磺化石墨固体溶解于50 mL双蒸水，常温下超声5小时，充分剥离后得到2.389 mg/mL透明澄清的棕黑色磺化石墨烯水溶液。

所述铂-磺化石墨烯复合纳米材料中铂纳米粒子的平均粒径为7.5 nm，铂元素以0价和+4价两种形式存在。

催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物，该产物在652 nm处有最大吸收峰。

铂-磺化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐反应体系的最佳条件为：pH为5.0，温度为37 ℃，铂-磺化石墨烯复合纳米材料的用量为1.125 μg/mL，3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的浓度为0.338 mmol/L，反应时间为10 min。

铂-磺化石墨烯复合纳米材料对3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的米氏常数为0.06244 mmol/L，对过氧化氢的米氏常数为47.76 mmol/L。

铂-磺化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的显色产物吸光值与0.01~1 mmol/L浓度范围内的过氧化氢呈线性关系，检测限为0.0025 mmol/L。

本发明所述的铂-磺化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，具体技术方案为：

（一）磺化石墨烯的制备：首先，将Hummers法制备出的氧化石墨烯分散于去离子水中，超声处理3小时得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散体系。往氧化石墨烯分散体系加入5%碳酸钠溶液，使得体系pH值为9~10，然后加入30 mL浓度为 0.16 g/mL 硼氢化钠溶液，在80 ℃下搅拌反应1小时，8000转/分钟离心后用水洗涤沉淀，得到中性的还原氧化石墨烯。将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液75 mL，再将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液中并在冰浴条件下搅拌反应2小时，离心后用双蒸水洗涤沉淀至pH值为7，得到呈中性的耦合物。将上述所得的耦合物分散于150 mL去离子水中，加入10 mL浓度为1.6 g/mL水合肼，在100 ℃下搅拌24小时进行还原反应，然后滴加5%碳酸钠溶液沉淀磺化石墨烯，将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在一定温度下进行真空干燥，得到磺化石墨烯固体。取119.45 mg磺化石墨固体溶解于50 mL双蒸水，常温下超声5小时，充分剥离后得到2.389 mg/mL透明澄清的棕黑色磺化石墨烯水溶液。

（二）铂-磺化石墨烯复合纳米材料的制备：

往12.559 mL浓度为2.389 mg/mL的磺化石墨烯溶液中加入1.796 mL浓度7.9 mmol/L的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15分钟后，逐滴加入0.645 mL浓度为2.5 mg/mL硼氢化钠水溶液，搅拌4小时后即得铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液。所负载的纳米铂粒子平均粒径为7.5 nm，4 ℃保存，能保持2个月以上的相对稳定。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。

（三）铂-磺化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶活性：

通过铂-磺化石墨烯复合纳米材料催化过氧化物酶底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（TMB）产生蓝色底物，验证和比较其过氧化物酶活性。在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中依次加入过氧化氢、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后温浴10分钟，肉眼观察颜色的变化或测定652 nm波长处的吸光度值。根据溶液颜色或通过测定吸光度值进行比较过氧化物酶活性。

（四）铂-磺化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶检测过氧化氢：

通过铂-磺化石墨烯复合纳米材料催化过氧化物酶底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐产生蓝色底物，检测低浓度过氧化氢。最优条件下，在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中依次加入过氧化氢、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后温浴10分钟，测定652 nm波长处的吸光度值。通过吸光度值标准曲线对过氧化氢浓度进行定量。

本发明的优点：

（1）本发明所得到的铂-磺化石墨烯复合纳米材料稳定性好且制备方法简单。

（2）本发明铂-磺化石墨烯复合纳米材料具有良好的过氧化物酶活性。

（3）本发明铂-磺化石墨烯复合纳米材料对底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的亲和力高。

（4）本发明铂-磺化石墨烯复合纳米材料能定量检测过氧化氢，检测限低，灵敏度高。

附图说明

图1为铂-磺化石墨烯复合纳米材料透射电子显微镜图。

图2为铂-磺化石墨烯复合纳米材料铂元素的X射线光电子能谱图。

图3为铂-磺化石墨烯复合纳米材料的X射线衍射图。

图4为铂-磺化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的颜色变化图。从左到右依次为TMB+H₂O₂溶液、磺化石墨烯+TMB+H₂O₂溶液、铂-磺化石墨烯复合纳米材料+TMB+H₂O₂溶液，溶液由无色变为蓝色。

图5为铂-磺化石墨烯复合纳米材料终浓度对催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图6为pH值对铂-磺化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图7为温浴温度对铂-磺化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图8为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐浓度对铂-磺化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图9为反应时间对铂-磺化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图10为铂-磺化石墨烯复合纳米材料对于3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的稳态动力学曲线图。

图11为铂-磺化石墨烯复合纳米材料对于过氧化氢的稳态动力学曲线图。

图12为铂-磺化石墨烯复合纳米材料检测过氧化氢标准曲线图。

具体实施方式

实例1：

Hummers法制备氧化石墨烯：称取325目鳞片石墨2.7 g，加入到316 mL浓度为18.4 mol/L的浓硫酸和36 mL浓度为14.7 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分搅拌后，置于在0 ℃冰浴中。将16.2 g高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0 ℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35 ℃温水浴中，控温1小时，然后将所得墨绿混悬液转移至50 ℃温水浴中，控温12小时得到紫黑色混悬液混合物。360 mL冰水缓慢加入到得到的紫黑色混悬液混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加12 mL 30wt%过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，搅拌30 分钟。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，继而4000 转每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入180 mL 超纯水充分振荡洗涤，4000 转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入180 mL 30wt% 盐酸充分振荡洗涤，经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤去除不溶颗粒，滤液4000 转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000 转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。

实例2：

对氨基苯磺酸重氮盐制备：在装有冷凝管、搅拌器、滴液漏斗和温度计的150 mL四颈瓶中放入10 mL 5 wt%碳酸钠溶液及2.1 g对氨基苯磺酸晶体，搅拌下温热使其溶解，再加入0.8 g亚硝酸钠与6 mL水配成的溶液，用冰浴冷至0~5 ℃。在不断搅拌下，将3 mL浓盐酸与10 mL水配成的溶液滴入上述混合溶液中，在冰浴中继续搅拌15 min，得到对氨基苯磺酸重氮盐。

实例3：

将Hummers法制备出的氧化石墨烯分散于去离子水中，超声处理3小时得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散体系。往氧化石墨烯分散体系加入5wt%碳酸钠溶液，使得体系pH值为9~10，然后加入30 mL浓度为 0.16 g/mL 硼氢化钠溶液，在80 ℃下搅拌反应1小时，8000转/分钟离心后用水洗涤沉淀，得到中性的还原氧化石墨烯。将还原氧化石墨烯分散于去离子水中，得到还原氧化石墨烯悬浮液75 mL，再将对氨基苯磺酸重氮盐加入到还原氧化石墨烯悬浮液中并在冰浴条件下搅拌反应2小时，离心后用双蒸水洗涤沉淀至pH值为7，得到呈中性的耦合物。将上述所得的耦合物分散于150 mL去离子水中，加入10 mL浓度为1.6 g/mL水合肼，在100 ℃下搅拌24小时进行还原反应，然后滴加5 wt %碳酸钠溶液沉淀磺化石墨烯，将上述制得的磺化石墨烯用双蒸水进行彻底洗涤，然后将磺化石墨烯在60 ℃下进行真空干燥，得到磺化石墨烯固体。取119.45 mg磺化石墨固体溶解于50 mL双蒸水，常温下超声5小时，充分剥离后得到2.389 mg/mL透明澄清的棕黑色磺化石墨烯水溶液。

实例4：

往12.559 mL浓度为2.389 mg/mL的磺化石墨烯溶液中加入1.796 mL浓度7.9 mmol/L的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15分钟后，逐滴加入0.645 mL浓度为2.5 mg/mL硼氢化钠水溶液，搅拌4小时后即得铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液。一定温度下真空干燥后得到铂-磺化石墨烯复合纳米材料粉末。

实例5：

将实施例4所制得的铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液滴涂到铜网上，进行透射电子显微镜测试，结果表明铂-磺化石墨烯复合纳米材料中铂纳米粒子的平均粒径为7.5 nm（见图1）。

实例6：

取一定量实施例4所制得的铂-磺化石墨烯复合纳米材料粉末，进行X射线光电子能谱测试，结果表明铂-磺化石墨烯复合纳米材料中铂元素以0价和+4价两种形式存在（见图2）。

实例7：

取一定量实施例4所制得的铂-磺化石墨烯复合纳米材料粉末，进行X射线衍射测试。如图3所示，2θ=40.08º、46.02º和60.27º处为铂的特征峰，分别对应铂的（111）、（200）和 （220）晶面；2θ=24.1º处为磺化石墨烯的特征峰。

实例8：

在1.74 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL浓度为0.1 mmol/L的过氧化氢、0.04 mL浓度为16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和40 μL浓度为1.125 µg/mL的铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后37 ℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色。当不加铂-磺化石墨烯复合纳米材料或加入磺化石墨烯溶液时，反应体系不发生颜色反应（见图4）。

实例9：

在1.74 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL浓度为0.1 mmol/L的过氧化氢、0.04 mL浓度为16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和40 μL不同浓度的铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后37℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。如图5所示，显色产物的吸光度随着铂-磺化石墨烯复合纳米材料终浓度增大而增大，但当铂-磺化石墨烯复合纳米材料的浓度达到1.125 μg/mL后，体系的吸光值趋于平缓，故选择铂-磺化石墨烯复合纳米材料的最佳用量为1.125 μg/mL。

实例10：

在pH值分别为3、4、4.5、5、5.5、6、7、8的1.74 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（200 mmol/L）中依次加入0.18 mL浓度为0.1 mmol/L的过氧化氢、0.04 mL浓度为16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和40 μL浓度为1.125 µg/mL的铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后37 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。铂-磺化石墨烯复合纳米材料的相对催化活性在磷酸盐缓冲液pH值为4.5~5.0时达到最大（见图6），故选择反应体系的最佳pH值为5.0。

实例11：

在1.74 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL浓度为0.1 mmol/L的过氧化氢、0.04 mL浓度为16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和40 μL浓度为1.125 µg/mL的铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后在不同温度10℃、20℃、30℃、37℃、45℃、50℃、60℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。如图7所示，在温度10~37℃间，吸光度值缓慢增大，当温度高于37℃时，吸光值则出现明显的下降趋势，故选择反应体系的最佳温度为37℃。

实例12：

在1.74 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL浓度为0.1 mmol/L的过氧化氢、0.04 mL不同浓度的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和40 μL浓度为1.125 µg/mL的铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后37℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。如图8所示，显色产物的吸光度随着3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐终浓度增大而增大，当浓度达到0.338 mmol/L后吸光度几乎不再增大，故反应体系的最佳TMB浓度为0.338 mmol/L。

实例13：

在1.74 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL浓度为0.1 mmol/L的过氧化氢、0.04 mL浓度为16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和40 μL浓度为1.125 µg/mL的铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后37℃温浴反应，测定不同时间下652 nm波长处吸光度。如图9所示，随着反应时间的延长，吸光度值逐渐增大，在反应时间达10 min之后，吸光度值变化缓慢，故选择反应体系的最佳反应时间为10 min。

实例14：

在1.74 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL浓度为0.1 mmol/L的过氧化氢、0.04 mL不同浓度的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和40 μL浓度为1.125 µg/mL的铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后37℃温浴反应1分钟，测定652 nm波长处吸光度，计算初速度。通过米氏方程拟合，可以得出铂-磺化石墨烯复合纳米材料对底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的米氏常数为0.06244 mmol/L（见图10）。

实例15：

在1.74 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL不同浓度的过氧化氢、0.04 mL浓度为16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和40 μL浓度为1.125 µg/mL的铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后37℃温浴反应1分钟，测定652 nm波长处吸光度，计算初速度。通过米氏方程拟合，可以得出铂-磺化石墨烯复合纳米材料对底物过氧化氢的米氏常数为47.76 mmol/L（见图11）。

实例16：

在1.74 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL不同浓度的过氧化氢、0.04 mL浓度为16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和40 μL浓度为1.125 µg/mL的铂-磺化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后37℃温浴反应10分钟，测定652 nm波长处吸光度。过氧化氢浓度在0.01~1 mmol/L范围内，显色产物的吸光度与过氧化氢浓度呈线性相关（r=0.997），式中r指相关系数，检测限为0.0025 mmol/L（见图12）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。