本发明涉及色谱柱，特别是一种dna折纸生物色谱柱的制备方法及其在药物筛选中的应用。
背景技术：
目前，应用于药物筛选的模型主要包括：整体动物水平模型、组织器官水平模型和细胞、分子水平模型。
整体动物模型药物筛选只能对有限的样品进行筛选，并且在实验动物身上复制出的病理模型十分有限，使用整体动物模型筛选新药具有显著的局限性、低效率和高成本等弊端。组织器官水平模型在一定程度上克服了整体动物模型的不足，但是仍然存在规模小、效率低、反应药物作用有限等缺点。细胞、分子水平的药物筛选模型是目前采用较多的一种方法，但是由于检测方法局限，可供药物筛选的检测指标十分有限，且该筛选模型准确性不高（药物到达细胞而非作用靶点）、筛选过程复杂（需要几天甚至更长的时间）、样品用量大（需要几十至几百毫克）。
2006年，rothemund首次提出了一种全新的dna自组装方法——dna折纸术（origami），并在nature杂志以封面论文发表。dna折纸具有生物相容性好、空间可寻址性、无细胞毒性及形状和尺寸可精确定义等优点，除此之外，dna折纸术还具有的显著特点有：1）组装过程简单；2）可精确组装多维纳米结构；3）可组装的对象种类繁多；4）可用于研究的领域广泛。
由于dna折纸具有良好的生物相容性、尺寸均匀、形状可控、表面容易修饰等优点，可以有效改善硅胶表面，使更多的受体或者化合物能够通过dna折纸键合到硅胶表面。但如何利用靶点（蛋白质、生物酶、膜受体、核受体及其他靶点化合物）与药物之间的特异性反应，实现药物筛选，并且对于了解药物在生物体内的分布、代谢等情况以及设计开发具有高活性,低毒性的药物分子都具有重要意义，但至今未见有该技术的公开报导。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种dna折纸生物色谱柱的制备方法及其在药物筛选中的应用，可有效解决现有技术中药物筛选准确性不高、过程复杂的问题。
本发明解决的技术方案是，本发明方法包括以下步骤：
1、活化硅胶及制备羧基化硅胶：
将硅胶置于体积浓度为20%的盐酸中回流5-7h，再用水洗至中性，在真空干燥箱中，于55-65℃下真空干燥12-18h（过夜），成活化硅胶，将活化硅胶置于无水甲苯中，加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷中，氮气保护下，100-120℃回流22-26h，用甲苯及乙醚分别洗涤3次，于真空干燥箱中55-65℃干燥12-18h（过夜），成氨基化硅胶，将氨基化硅胶超声分散于30ml四氢呋喃中，加入与γ-氨丙基三乙氧基硅烷等摩尔比的丁二酸酐，室温搅拌24h，用无水乙醇洗涤3~5次，于真空干燥箱中55-65℃干燥12-18h（过夜），成羧基化硅胶，所说的硅胶粒径：5µm，孔径：100-300å（市售产品如：青岛美高化工有限公司产品）；
2、dna折纸组装靶点：
将靶点用长度为10~30bp的单链dna修饰，即靶点化合物含有一段游离的dna链，订书钉链有216条，其中12条订书钉链的5′端用一段游离的单链dna修饰，与靶点化合物上的修饰dna链互补，3~5条订书钉链的5′端用氨基修饰，将m13mp18ssdna、216条订书钉链、靶点化合物按1:(5-10):1的摩尔比投料于pcr仪中，通过退火以6℃/min的速率从60℃降到35℃，即得到组装有靶点化合物的氨基化的dna折纸纳米结构，所述的靶点为蛋白质、生物酶、膜受体、核受体及其他靶点化合物；
3、组装靶点的dna折纸键合羧基化硅胶：
将步骤1制备的羧基化硅胶超声分散于ph值为7.2-7.4的pbs溶液中，加入6mgdcc与5mgnhs混匀，再加入组装了靶点化合物的氨基化的dna折纸4mg，于室温下搅拌22-26h，用ph值为7.2-7.4的pbs溶液及超纯水分别洗涤3次，于真空干燥箱中55-65℃干燥12-18h（过夜），得dna折纸生物色谱介质；
4、装柱制成dna折纸生物色谱柱：
取不锈钢液相色谱柱，在10~20mpa下，将步骤3制备的dna折纸生物色谱介质进行装柱，装柱用的匀浆液和顶替液均为ph值为7.2-7.4的pbs缓冲液，即得到dna折纸生物色谱柱，所述的锈钢液相色谱柱内腔直径为4.6mm，长为150mm。
该色谱柱有效用于药物筛选中。
本发明提供的适合于药物筛选的dna折纸色谱介质，其特征是以活化硅胶为基质，利用dna折纸的生物相容性好、空间可寻址性、可组装对象繁多及组装过程简单等优点将靶点（蛋白质、生物酶、膜受体、核受体及其他靶点化合物）组装到dna折纸纳米结构上，再将组装了靶点化合物的dna折纸键合到硅胶基质上而得到新型的生物色谱介质。所组装的对象可根据需要，组装不同的化合物。将所得到的生物色谱介质装填于液相色谱柱中，得到一种dna折纸生物色谱柱。具有使用简便、高效、准确性高和充分发挥药物作用，经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
本发明在具体实施中，由以下步骤实现：
1、活化硅胶及制备羧基化硅胶：
将硅胶置于体积浓度为20%的盐酸中回流6h，再用水洗至中性，在真空干燥箱中，于60℃下真空干燥15h（过夜），成活化硅胶，将活化硅胶置于无水甲苯中，加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷中，氮气保护下，110℃回流24h，用甲苯及乙醚分别洗涤3次，于真空干燥箱中60℃干燥15h（过夜），成氨基化硅胶，将氨基化硅胶超声分散于30ml四氢呋喃中，加入与γ-氨丙基三乙氧基硅烷等摩尔比的丁二酸酐，室温搅拌24h，用无水乙醇洗涤3~5次，于真空干燥箱中60℃干燥15h（过夜），成羧基化硅胶；
2、dna折纸组装靶点：
将靶点用长度为10~30bp的单链dna修饰，即靶点化合物含有一段游离的dna链，订书钉链有216条，其中12条订书钉链的5′端用一段游离的单链dna修饰，与靶点化合物上的修饰dna链互补，3~5条订书钉链的5′端用氨基修饰，将m13mp18ssdna、216条订书钉链、靶点化合物按1:5:1的摩尔比投料于pcr仪中，通过退火以6℃/min的速率从60℃降到35℃，即得到组装有靶点化合物的氨基化的dna折纸纳米结构；
3、组装靶点的dna折纸键合羧基化硅胶：
将步骤1制备的羧基化硅胶超声分散于ph值为7.2-7.4的pbs溶液中，加入6mgdcc与5mgnhs混匀，再加入组装了靶点化合物的氨基化的dna折纸4mg，于室温下搅拌24h，用ph值为7.2-7.4的pbs溶液及超纯水分别洗涤3次，于真空干燥箱中60℃干燥15h（过夜），得dna折纸生物色谱介质；
4、装柱制成dna折纸生物色谱柱：
取不锈钢液相色谱柱，在10~20mpa下，将步骤3制备的dna折纸生物色谱介质进行装柱，装柱用的匀浆液和顶替液均为ph值为7.2-7.4的pbs缓冲液，即得到dna折纸生物色谱柱，所述的锈钢液相色谱柱内腔直径为4.6mm，长为150mm。
实施例2：
本发明在具体实施中，由以下步骤实现：
1、活化硅胶及制备羧基化硅胶：
将硅胶置于体积浓度为20%的盐酸中回流5h，再用水洗至中性，在真空干燥箱中，于55℃下真空干燥18h（过夜），成活化硅胶，将活化硅胶置于无水甲苯中，加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷中，氮气保护下，100℃回流26h，用甲苯及乙醚分别洗涤3次，于真空干燥箱中55℃干燥18h（过夜），成氨基化硅胶，将氨基化硅胶超声分散于30ml四氢呋喃中，加入与γ-氨丙基三乙氧基硅烷等摩尔比的丁二酸酐，室温搅拌24h，用无水乙醇洗涤3~5次，于真空干燥箱中55℃干燥18h（过夜），成羧基化硅胶；
2、dna折纸组装靶点：
将靶点用长度为10~30bp的单链dna修饰，即靶点化合物含有一段游离的dna链，订书钉链有216条，其中12条订书钉链的5′端用一段游离的单链dna修饰，与靶点化合物上的修饰dna链互补，3~5条订书钉链的5′端用氨基修饰，将m13mp18ssdna、216条订书钉链、靶点化合物按1:8:1的摩尔比投料于pcr仪中，通过退火以6℃/min的速率从60℃降到35℃，即得到组装有靶点化合物的氨基化的dna折纸纳米结构，所述的靶点为蛋白质、生物酶、膜受体、核受体及其他靶点化合物；
3、组装靶点的dna折纸键合羧基化硅胶：
将步骤1制备的羧基化硅胶超声分散于ph值为7.2-7.4的pbs溶液中，加入6mgdcc与5mgnhs混匀，再加入组装了靶点化合物的氨基化的dna折纸4mg，于室温下搅拌22-26h，用ph值为7.2-7.4的pbs溶液及超纯水分别洗涤3次，于真空干燥箱中55℃干燥18h（过夜），得dna折纸生物色谱介质；
4、装柱制成dna折纸生物色谱柱：
取不锈钢液相色谱柱，在10~20mpa下，将步骤3制备的dna折纸生物色谱介质进行装柱，装柱用的匀浆液和顶替液均为ph值为7.2-7.4的pbs缓冲液，即得到dna折纸生物色谱柱，所述的锈钢液相色谱柱内腔直径为4.6mm，长为150mm。
实施例3
1、活化硅胶及制备羧基化硅胶：
将硅胶置于体积浓度为20%的盐酸中回流5-7h，再用水洗至中性，在真空干燥箱中，于65℃下真空干燥12h（过夜），成活化硅胶，将活化硅胶置于无水甲苯中，加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷中，氮气保护下，120℃回流22h，用甲苯及乙醚分别洗涤3次，于真空干燥箱中65℃干燥12h（过夜），成氨基化硅胶，将氨基化硅胶超声分散于30ml四氢呋喃中，加入与γ-氨丙基三乙氧基硅烷等摩尔比的丁二酸酐，室温搅拌24h，用无水乙醇洗涤3~5次，于真空干燥箱中65℃干燥12h（过夜），成羧基化硅胶；
2、dna折纸组装靶点：
将靶点用长度为10~30bp的单链dna修饰，即靶点化合物含有一段游离的dna链，订书钉链有216条，其中12条订书钉链的5′端用一段游离的单链dna修饰，与靶点化合物上的修饰dna链互补，3~5条订书钉链的5′端用氨基修饰，将m13mp18ssdna、216条订书钉链、靶点化合物按1:(5-10):1的摩尔比投料于pcr仪中，通过退火以6℃/min的速率从60℃降到35℃，即得到组装有靶点化合物的氨基化的dna折纸纳米结构，所述的靶点为蛋白质、生物酶、膜受体、核受体及其他靶点化合物；
3、组装靶点的dna折纸键合羧基化硅胶：
将步骤1制备的羧基化硅胶超声分散于ph值为7.2-7.4的pbs溶液中，加入6mgdcc与5mgnhs混匀，再加入组装了靶点化合物的氨基化的dna折纸4mg，于室温下搅拌22-26h，用ph值为7.2-7.4的pbs溶液及超纯水分别洗涤3次，于真空干燥箱中65℃干燥12h（过夜），得dna折纸生物色谱介质；
4、装柱制成dna折纸生物色谱柱：
取不锈钢液相色谱柱，在10~20mpa下，将步骤3制备的dna折纸生物色谱介质进行装柱，装柱用的匀浆液和顶替液均为ph值为7.2-7.4的pbs缓冲液，即得到dna折纸生物色谱柱，所述的锈钢液相色谱柱内腔直径为4.6mm，长为150mm。
上述实施例给出的dna折纸生物色谱柱有效用于药物筛选中。
本发明中dna折纸的构建参考2006年paulw.k.rothemund（rothemundpw.foldingdnatocreatenanoscaleshapesandpatterns[j].nature,2006,440:297~302）发表的文章中矩形折纸的构建，m13噬菌体的单链环状dna作为脚手架链，216条长短不一的短链dna作为订书钉链。本发明将paulw.k.rothemund文章中编号为4、13、55、63、102、106、116、123、162、170、208、212等12条订书钉链在3’端采用20个碱基序列（attctacttgagagagcgac）进行修饰，编号为100、105、110等3条订书钉链在5’端采用氨基（nh2-c6-tttttttttt）进行修饰。其他编号的订书钉链未经修饰，不再列出。
4gagccgccccaccaccggaaccgcgacggaaaattctacttgagagagcgac
13atcggctgcgagcatgtagaaacctatcatatattctacttgagagagcgac
55caccagagttcggtcatagcccccgccagcaaattctacttgagagagcgac
63caagcaagacgcgcctgtttatcaagaatcgcattctacttgagagagcgac
102acaaacaattttaatcagtagcgacagatcgatagcattctacttgagagagcgac
106tatagaagttttcgacaaaaggtaaagtagagaataattctacttgagagagcgac
116ttcgccattgccggaaaccaggcattaaatcaattctacttgagagagcgac
123ttttaattgcccgaaagacttcaaaacactatattctacttgagagagcgac
162cagctggcggacgacgacagtatcgtagccagattctacttgagagagcgac
170tacctttaaggtctttaccctgacaaagaagtattctacttgagagagcgac
208cacgacgtttttgtaatgggataggtcaaaacggcgattctacttgagagagcgac
212atataatgttttcattgaatccccctcaaatcgtcaattctacttgagagagcgac
100nh2-c6-tttttttttttttttataagtatagcccggccgtcgag
105nh2-c6-ttttttttttgcgcattattttgcttatccggtattctaaatcaga
110nh2-c6-ttttttttttgatggcaattttaatcaatatctggtcacaaatatc
上述给出的实施例仅是用于说明本发明的具体实施方式，并不是用于限制本发明的保护范围，凡是在本质上与本发明技术方案相同的各种改进、变换或替代均属于本发明的保护范围，本发明经实验其效果非常之好，使用方便，准确性高，效率高，有关资料如下：
实验1：
本发明以靶点化合物为牛血清白蛋白为例，具体实验情况如下：
本实验中以制备的dna折纸生物色谱柱（其中的靶点化合物为牛血清白蛋白）对阿司匹林在磷酸盐缓冲液为流动相的条件下进行分析，阿司匹林在本发明新型生物色谱柱（以牛血清白蛋白为靶点）上有保留，保留时间为3.937min；阿司匹林在硅胶色谱柱上没有保留，随着溶剂乙醇出峰。色谱条件如下：流动相为20mm的磷酸盐缓冲液，流速为0.8ml/min，柱温30℃，阿司匹林的浓度为0.1mg/ml，进样体积为20µl。
阿司匹林在本发明制备的新型dna折纸生物色谱柱上与bsa产生了受体-配体的特异亲和作用，而阿司匹林在硅胶色谱柱上没有保留，随着溶剂出峰。阿司匹林在两个色谱柱上保留时间的差异，说明硅胶本身对阿司匹林是无保留的，其在本发明制备的新型dna折纸生物色谱柱上的保留是其与bsa之间的特异性作用。相比直接将具有生物活性的bsa键合到无机硅胶表面来筛选或分析药物的方法，本发明所提供的方法通过将bsa组装到dna折纸上，再通过edc和nhs的作用键合到羧基化硅胶上，利用dna折纸的生物相容性有效地改善无机硅胶的表面，可以有效地保持bsa的生物活性。而相比于传统的药物筛选模型，本发明制备的新型dna折纸生物色谱柱可直接利用高效液相色谱仪进行分析，使得此筛选方法更加准确（药物直达作用靶点）、简便（15min之内即可进行分析），检测方法灵敏（进样量为20μg），分析结果更加直观，并且使用的流动相亦环保易得。除此之外，本发明所提供的药物筛选模型是首次将dna折纸与液相色谱仪联合用于药物筛选，因此本发明所提供的药物筛选模型更具创新性。
实验2：
本发明以靶点化合物为生物酶的脂肪酶制备的dna折纸生物色谱柱（其中的靶点化合物为脂肪酶）对黄芩苷在磷酸盐缓冲液为流动相的条件下进行分析。黄芩苷在本发明生物色谱柱（以脂肪酶为靶点）上有保留，保留时间为9.733min；阿司匹林在硅胶色谱柱上没有保留，随着溶剂甲醇出峰。色谱条件如下：流动相为20mm的磷酸盐缓冲液，流速为0.4ml/min，柱温为30℃，黄芩苷的浓度为0.1mg/ml，进样体积为20µl。
黄芩苷在本发明制备的dna折纸生物色谱柱上与脂肪酶产生了受体-配体的特异亲和作用，而黄芩苷在硅胶色谱柱上没有保留，随着溶剂出峰。黄芩苷在两个色谱柱上保留时间的差异，说明硅胶本身对黄芩苷是无保留的，其在本发明制备的dna折纸生物色谱柱上的保留是其与脂肪酶之间的特异性作用。相比直接将具有生物活性的脂肪酶键合到无机硅胶表面来筛选或分析药物的方法，本发明所提供的方法通过将脂肪酶组装到dna折纸上，再通过edc和nhs的作用键合到羧基化硅胶上，利用dna折纸的生物相容性有效地改善无机硅胶的表面，可以有效地保持脂肪酶的生物活性。而相比于传统的药物筛选模型，本发明制备的新型dna折纸生物色谱柱可直接利用高效液相色谱仪进行分析，使得此筛选方法更加准确（药物直达作用靶点）、简便（15min之内即可进行分析），检测方法灵敏（进样量为20μg），分析结果更加直观，并且使用的流动相无毒、易得。除此之外，本发明所提供的药物筛选模型是首次将dna折纸与液相色谱仪联合用于药物筛选，因此本发明所提供的药物筛选模型更具创新性。
综上所述，本发明涉及一种dna折纸生物色谱柱的制备，并利用其组装的靶点（蛋白质、生物酶、膜受体、核受体及其他靶点化合物）与药物之间的特异性来实现药物的筛选。本发明利用了dna折纸的诸多优点以及液相色谱的高效、简便，相比于目前使用的细胞、分子水平的药物筛选模型，本药物筛选方法更具准确性药物直达作用靶点、充分利用药物大大提高了疗效，药物利用率提高几十甚至上百倍，成本低，样品用量减少数千倍，具有很强的使用价值，经济和社会效益巨大。
sequencelisting
<110>郑州大学
<120>一种dna折纸生物色谱柱的制备方法及其在药物筛选中的应用
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