一种二氧化硅@P-A-β-CD/NIPAM吸附介质的制备方法及其应用与流程

本发明属于固相微萃取技术领域，具体涉及一种sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质的制备方法及其用于固相微萃取的应用。

背景技术：

环境水中的有机污染物种类繁多，基质复杂，含量低，而且随环境变化快、影响因素多、涉及范围广，是一个突出的环境问题，也是环境科学研究的热点。与分析仪器的飞速发展相比，样品前处理技术发展相对滞后，其决定着分析过程的速度及准确性，也是制约在线分析仪器应用的瓶颈。因此，设计具有功能化、多作用模式的复杂样品前处理体系，使其在在线监测中达到快速、稳定性好的特性，成为当前该领域研究的当务之急。

现有对环境水中的酚类有机污染物富集的方法主要是固相萃取法，而商用的萃取柱皆为直径约1cm的塑料一次性商品柱，价格昂贵，不能同时对多种基质进行富集净化，且其分析耗时长、误差大，难于实现在线，不可重复利用；毛细管微柱由于容量的问题，一般需要通过增加长度来提高容量，但这会使得系统压力增大，同样使在线前处理系统的稳定性降低。在线监测因前处理吸附介质的记忆效应及较慢的解离速度导致时间分辨率差、误差大，且使用的萃取柱体积较大，因此具有死体积大、柱压高等缺陷。因此样品预处理中吸附介质的功能化和前处理萃取柱的设计成为在线分析系统的关键问题。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明提供一种二氧化硅@p-a-β-cd/nipam（即sio2@p-a-β-cd/nipam，中文名称为：丙烯酰环糊精和异丙基丙烯酰胺接枝的二氧化硅微球）吸附介质的制备方法，所述吸附介质能作为固相萃取、固相微萃取等的固定相，可实现对目标化合物的高效分离富集。同时，本发明还提供将所述吸附介质用于固相萃取柱的应用、以及使用所述萃取柱进行环境水中有机污染物的在线检测方法。

一种sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质的制备方法，包括以下步骤：

（1）合成丙烯酰环糊精（简称a-β-cd）功能单体；

（2）用硅烷偶联剂kh570对sio2进行硅烷化，得到硅烷化的sio2（简称sio2@kh570）；

（3）合成sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质：将0.3-0.8g硅烷化的sio2分散在20ml干燥的dmf中，加入20-30mg偶氮二异丁腈，在n2氛围中，60-80℃的条件下，向其中逐滴加入1-6mmol异丙基丙烯酰胺和浓度为0.05mol/l的丙烯酰环糊精功能单体的dmf溶液20ml，加入完毕后，搅拌24-48h，然后离心，将离心得到的沉淀用蒸馏水和甲醇交替洗涤5次，除去未接枝到sio2表面的单体及其自聚产物，将沉淀在50℃真空干燥2天，即得到丙烯酰环糊精和异丙基丙烯酰胺接枝的二氧化硅微球吸附介质（简称sio2@p-a-β-cd/nipam）。

优选地，步骤（2）中采用kh570对sio2进行硅烷化的具体操作如下：

（2a）将4gsio2浸泡在质量浓度10%的盐酸溶液中，在110℃下活化12h，过滤，将得到的滤渣用蒸馏水洗涤至中性，然后在50℃下真空干燥2天，得到活化的sio2；

（2b）将2-5g活化的sio2分散于15-20ml干燥的甲苯中，在n2氛围中，向其中逐滴加入体积浓度为14%的kh570的甲苯溶液20-25ml，回流冷凝，在110℃下搅拌36h，然后离心，将离心得到的沉淀用甲苯、甲醇交替洗涤5次，除掉未反应的kh570及其自聚产物，在50℃下真空干燥3天，得到硅烷化的sio2（简称sio2@kh570）。

优选地，步骤（1）中合成丙烯酰环糊精功能单体的步骤具体如下：

（1a）将5mmolβ-环糊精加入到20ml干燥的dmf中，然后加入20mmol三乙胺，在冰水浴中搅拌；

（1b）将20mmol丙烯酰氯加入到20ml干燥的dmf中；

（1c）在n2氛围中，将步骤（1b）得到的溶液逐滴加入步骤（1a）得到的溶液中，加入完毕后，在冰水浴中搅拌反应24h，然后过滤，将滤液在足量丙酮中沉淀，重复3次，得到白色沉淀，在20℃下真空干燥3天，得到丙烯酰环糊精（简称a-β-cd）功能单体。

一种固相微萃取柱，包括萃取柱管、滤片、螺帽，在所述萃取柱管的上下两端中心位置分别对称设置有凸起，凸起上设置有滤片；所述螺帽的中心位置轴向设置有通孔；所述凸起伸入通孔与螺帽的一端通过螺纹结构连接，所述螺帽的另一端通过螺纹结构与螺帽接头相连，且所述滤片与螺帽接头相抵，螺帽接头上连接有peek管；所述萃取柱管、凸起、螺帽接头均为中空结构，且所述萃取柱管、凸起、螺帽接头的中空结构相连通形成萃取通道，两个peek管通过萃取通道相连通；所述萃取柱管内部填充有温敏吸附介质，所述温敏吸附介质是采用上述方法制备得到的sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质。

优选地，所述萃取柱管、螺帽均为正六棱柱，所述正六棱柱的内切圆直径为1-2毫米

优选地，所述萃取柱管的高度为2厘米、螺帽的高度为2厘米。

优选地，所述萃取柱管、螺帽、螺帽接头均采用不锈钢材料。

优选地，所述滤片采用烧结不锈钢材料，所述凸起采用聚酰亚胺材料。

上述固相微萃取柱的应用，具体为：采用上述固相微萃取柱对水中的酚类物质进行富集，使用固相微萃取-高效液相色谱联用仪进行在线检测，来检测水中的酚类物质。

本发明中：dmf指n,n-二甲基甲酰胺；nipam指n-异丙基丙烯酰胺。

本发明的优点：

（1）本发明提供的sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质，能使酚类有机污染物在其表面达到快速的吸附和解析，能用于在线检测；

（2）本发明提供的萃取柱，稳定好，可重复利用，用于固相微萃取-高效液相色谱联用仪来检测水中的酚类物质，准确性好。

附图说明

图1扫描电镜图。

图2红外光谱检测图谱。

图3固相萃取柱的零部件示意图。

图4固相萃取柱结构示意图；

其中，11：螺帽；21：滤片；31：萃取柱管；41：螺帽接头；51：凸起；61：peek管。

图5固相微萃取-高效液相色谱联用仪中六通阀的连接关系示意图；

其中，其中，511-六通阀。

图6固相微萃取柱柱温在高温（50℃）的色谱图。

图7固相微萃取柱柱温在低温（25℃）的色谱图。

图8水样未加标时的色谱图。

图9水样加标0.5ng/ml时的色谱图。

图10水样加标5ng/ml时的色谱图；

其中，1：对硝基苯酚（pnp）；2：β-萘酚(β-np)；3：双酚a（bpa）；4：2，4-二氯苯酚（2，4-dcp）；5：2，4，6-三氯苯酚（2,4,6-tcp）。

具体实施方式

实施例1

一种sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质的制备方法，包括以下步骤：

（1）合成丙烯酰环糊精功能单体：

（1a）将5mmolβ-环糊精（β-cd）加入到20ml干燥的dmf（n,n-二甲基甲酰胺）中，然后加入20mmol三乙胺，在冰水浴中搅拌；

（1b）将20mmol丙烯酰氯加入到20ml干燥的dmf中；

（1c）在n2氛围中，将步骤（1b）得到的溶液逐滴加入步骤（1a）得到的溶液中，加入完毕后，在冰水浴中搅拌反应24h，然后过滤，将滤液在足量丙酮中沉淀，重复3次，得到白色沉淀，在20℃下真空干燥3天，得到丙烯酰环糊精（简称a-β-cd）功能单体；

（2）用硅烷偶联剂kh570对sio2进行硅烷化，得到硅烷化的sio2：

（2a）将4gsio2浸泡在质量浓度10%的盐酸溶液中，在110℃下活化12h，过滤，将得到的滤渣用蒸馏水洗涤至中性，然后在50℃下真空干燥2天，得到活化的sio2；

（2b）将3.5g活化的sio2分散于17ml干燥的甲苯中，在n2氛围中，向其中逐滴加入体积浓度为14%的kh570的甲苯溶液21ml，回流冷凝，在110℃下搅拌36h，然后离心，将离心得到的沉淀用甲苯、甲醇交替洗涤5次，除掉未反应的kh570及其自聚产物，在50℃下真空干燥3天，得到硅烷化的sio2（简称sio2@kh570）；

（3）合成sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质：将0.5g硅烷化的sio2分散在20ml干燥的dmf中，加入25mg偶氮二异丁腈，在n2氛围中，70℃的条件下，向其中逐滴加入4mmol异丙基丙烯酰胺和浓度为0.05mol/l的丙烯酰环糊精功能单体的dmf溶液20ml，加入完毕后，搅拌36h，然后离心，将离心得到的沉淀用蒸馏水和甲醇交替洗涤5次，除去未接枝到sio2的单体及其自聚产物，将沉淀在50℃真空干燥2天，即得到丙烯酰环糊精和异丙基丙烯酰胺接枝的二氧化硅微球吸附介质（简称sio2@p-a-β-cd/nipam）。

实施例2

一种sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质的制备方法，包括以下步骤：

（1）合成丙烯酰环糊精功能单体：

（1a）将5mmolβ-环糊精（β-cd）加入到20ml干燥的dmf（n,n-二甲基甲酰胺）中，然后加入20mmol三乙胺，在冰水浴中搅拌；

（1b）将20mmol丙烯酰氯加入到20ml干燥的dmf中；

（1c）在n2氛围中，将步骤（1b）得到的溶液逐滴加入步骤（1a）得到的溶液中，加入完毕后，在冰水浴中搅拌反应24h，然后过滤，将滤液在足量丙酮中沉淀，重复3次，得到白色沉淀，在20℃下真空干燥3天，得到丙烯酰环糊精功能单体；

（2）用硅烷偶联剂kh570对sio2进行硅烷化，得到硅烷化的sio2：

（2a）将4gsio2浸泡在质量浓度10%的盐酸溶液中，在110℃下活化12h，过滤，将得到的滤渣用蒸馏水洗涤至中性，然后在50℃下真空干燥2天，得到活化的sio2；

（2b）将2g活化的sio2分散于15ml干燥的甲苯中，在n2氛围中，向其中逐滴加入体积浓度为14%的kh570的甲苯溶液20ml，回流冷凝，在110℃下搅拌36h，然后离心，将离心得到的沉淀用甲苯、甲醇交替洗涤5次，在50℃下真空干燥3天，得到硅烷化的sio2；

（3）合成sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质：将0.3g硅烷化的sio2分散在20ml干燥的dmf中，加入20mg偶氮二异丁腈，在n2氛围中，60℃的条件下，向其中逐滴加入1mmol异丙基丙烯酰胺和浓度为0.05mol/l的丙烯酰环糊精功能单体的dmf溶液20ml，加入完毕后，搅拌48h，然后离心，将离心得到的沉淀用蒸馏水和甲醇交替洗涤5次，除去未接枝到sio2的单体及其自聚产物，将沉淀在50℃真空干燥2天，即得到sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质。

实施例3

一种sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质的制备方法，包括以下步骤：

（1）合成丙烯酰环糊精功能单体：

（1a）将5mmolβ-环糊精（β-cd）加入到20ml干燥的dmf（n,n-二甲基甲酰胺）中，然后加入20mmol三乙胺，在冰水浴中搅拌；

（1b）将20mmol丙烯酰氯加入到20ml干燥的dmf中；

（1c）在n2氛围中，将步骤（1b）得到的溶液逐滴加入步骤（1a）得到的溶液中，加入完毕后，在冰水浴中搅拌反应24h，然后过滤，将滤液在足量丙酮中沉淀，重复3次，得到白色沉淀，在20℃下真空干燥3天，得到丙烯酰环糊精功能单体；

（2）用硅烷偶联剂kh570对sio2进行硅烷化，得到硅烷化的sio2：

（2a）将4gsio2浸泡在质量浓度10%的盐酸溶液中，在110℃下活化12h，过滤，将得到的滤渣用蒸馏水洗涤至中性，然后在50℃下真空干燥2天，得到活化的sio2；

（2b）将5g活化的sio2分散于20ml干燥的甲苯中，在n2氛围中，向其中逐滴加入体积浓度为14%的kh570的甲苯溶液25ml，回流冷凝，在110℃下搅拌36h，然后离心，将离心得到的沉淀用甲苯、甲醇交替洗涤5次，除掉未反应的kh570及其自聚产物，在50℃下真空干燥3天，得到硅烷化的sio2；

（3）合成sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质：将0.8g硅烷化的sio2分散在20ml干燥的dmf中，加入30mg偶氮二异丁腈，在n2氛围中，80℃的条件下，向其中逐滴加入6mmol异丙基丙烯酰胺和浓度为0.05mol/l的丙烯酰环糊精功能单体的dmf溶液20ml，加入完毕后，搅拌24h，然后离心，将离心得到的沉淀用蒸馏水和甲醇交替洗涤5次，除去未接枝到sio2的单体及其自聚产物，将沉淀在50℃真空干燥2天，即得到sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质。

一.性能检测

1.扫描电镜检测

对sio2接枝前后做扫描电镜图，见图1，其中，a、a1为未做任何处理的sio2，b,b1-为步骤（3）得到的sio2@p-a-β-cd/nipam；

由图1可知，相比a,a1，图b,b1表面明显变得“粗糙”，证明sio2表面有物质接枝成功。

2.红外光谱检测

对实施例1制备得到的sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质做红外光谱检测，结果如图2所示，其中，a是sio2的红外光谱图，b是步骤（2）得到的硅烷化的sio2的红外光谱图，c是步骤（3）得到的sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质的红外光谱图。

由图2可知，与a相比，b在2978cm^-1和2852cm^-1处的吸收峰均是c-h伸缩振动，1725cm^-1是c=o的伸缩振动，证明偶联成功；c在1542cm^-1处的吸收为酰胺基团游离氨基的特征吸收峰，1454cm^-1和1392cm^-1的吸收峰为异丙基的特征吸收峰，说明吸附介质sio2@p-a-β-cd/nipam的合成成功。

实施例4

结合图3和图4对固相微萃取柱进行详细说明：

一种固相微萃取柱，包括萃取柱管（31）、滤片（21）、螺帽（11），在所述萃取柱管（31）的上下两端中心位置分别对称设置有凸起（51），凸起（51）上设置有滤片（21）；所述螺帽（11）的中心位置轴向设置有通孔；所述凸起（51）伸入通孔与螺帽（11）的一端通过螺纹结构连接，所述螺帽（11）的另一端通过螺纹结构与螺帽接头（41）相连，且所述滤片（21）与螺帽接头（41）相抵，螺帽接头（41）上连接有peek管（61）；所述萃取柱管（31）、凸起（51）、螺帽接头（41）均为中空结构，且所述萃取柱管（31）、凸起（51）、螺帽接头（41）的中空结构相连通形成萃取通道，两个peek管（61）通过萃取通道相连通；所述萃取柱管（31）内部填充有温敏吸附介质，所述温敏吸附介质是采用实施例1制备得到的sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质；

其中，所述萃取柱管（31）、螺帽（11）均为正六棱柱，所述正六棱柱的内切圆直径为1-2毫米；

所述萃取柱管（31）的高度为2厘米、螺帽（11）的高度为2厘米；

所述萃取柱管（31）、螺帽（11）、螺帽接头（41）均采用不锈钢或者黄铜材料；

所述滤片（21）采用烧结不锈钢材料，所述凸起（51）采用聚酰亚胺材料。

实施例5

采用实施例4提供的固相微萃取柱，使用固相微萃取-高效液相色谱联用仪进行在线检测，来检测水中的酚类物质，具体如下：

固相微萃取-高效液相色谱联用仪包括固相微萃取柱、六通阀、两个泵(分别为1号泵和2号泵)、两个废液瓶（分别为1号废液瓶和2号废液瓶）；1号泵用来控制样品进液，2号泵为梯度泵，用来控制洗脱液进液，2号泵可以同时连接2-4种洗脱液，两个泵都可以控制进液流速；1号废液瓶用来接收样品经过萃取柱富集后的废液，2号废液瓶用来接收洗脱液经过高效液相色谱的分析柱洗脱分离后所产生的废液；

六通阀分别与1号泵、2号泵、1号废液瓶、固相微萃取柱、高效液相色谱的分析柱相连；1号泵位于样品与固相微萃取柱之间，2号泵位于洗脱液与固相微萃取柱之间；采样时六通阀位于load位置，开启1号泵，样品经1号泵驱动、经过固相微萃取柱富集样品、废液留进1号废液瓶；进样时六通阀位于inject位置，洗脱液（即流动相）经2号泵驱动、经过固相微萃取柱解吸附样品进入高效液相色谱仪的分析柱待测；检测时六通阀位于load位置，洗脱液（即流动相）经2号泵驱动、对分析柱内的样品进行分离、检测后产生的废液流入2号废液瓶；其中，六通阀置于load和inject位置时的示意图见图5；

具体操作如下：

步骤一：采取固相微萃取-高效液相色谱联用仪，在室温下，将六通阀置于load位置，开启1号泵，样品在1号泵的驱动作用下，以0.3-1ml/min的流速进入固相微萃取柱对含酚类物质的样品进行富集，富集样品30ml-50ml，样品经过固相微萃取柱后进入1号废液瓶；富集结束后，关掉1号泵；

步骤二：将六通阀置于inject位置，开启2号泵，洗脱液在2号泵的作用下，以0.3ml/min的流速洗脱固相微萃取柱1.7min，萃取柱柱温大于40℃，使吸附在固相微萃取柱上的酚类物质完全解吸附，洗脱产生的液体进入高效液相色谱仪的分析柱；所述洗脱液是洗脱液a和洗脱液b以体积比a:b=15:85的混合液，其中洗脱液a为甲醇，洗脱液b为ph=3的磷酸缓冲液；

步骤三：将六通阀再次置于load位置，将洗脱液在2号泵的作用下进行梯度洗脱，以1ml/min的流速进入高效液相色谱仪的分析柱对酚类物质进行分离，并经高效液相色谱仪的检测器对其完成检测；所述洗脱为梯度洗脱：在20.3min内，洗脱液a和洗脱液b的体积比是由a:b=15:85经过梯度泵逐渐变化为40:60；其中洗脱液a为甲醇，洗脱液b为ph=3的磷酸缓冲液。

二.检测方法的可行性

对固相微萃取柱中的sio2@p-a-β-cd/nipam吸附介质的温敏性进行检测验证：

1.取5个标准样品，分别为：

1：对硝基苯酚（pnp）；

2：β-萘酚(β-np)；

3：双酚a（bpa）；

4：2，4-二氯苯酚（2，4-dcp）；

5：2，4，6-三氯苯酚（2,4,6-tcp），作为分析对象，每个标准样品的浓度为20ng/ml；

采用实施例5提供的检测方法，分别用5个标注样品代替实施例5中的检测样品，每个样品取30ml，步骤二中的柱温分别在高温（50℃）和低温（25℃）进行检测，结果如下：

固相微萃取柱柱温在高温（50℃）和低温（25℃）时的色谱图，检测结果分别见图6、图7，由图6可知，高温（50℃）色谱图中5个标准品的出峰时间分别为6.55min、12.45min、14.40min、15.72min、19.87min；图7中低温色谱图中5个标准品的保留时间为6.63min、12.53min、未出峰、15.77min、19.89min，低温时各组分保留时间均滞后、峰面积较高温时小且bpa并未出峰，这主要是由于聚异丙基丙烯酰胺（nipam）链与bpa的超分子及氢键作用所致，说明吸附介质sio2@p-a-β-cd/nipam具有温敏性，且在高温条件下能够对客体分子酚类污染物快速解吸附。

温敏性吸附介质具有环境刺激响应性，对富集的有机污染物进行充分洗脱时，固相微萃取柱在高温时，有机物被完全洗脱出来；在低温时，则有机物不能被完全洗脱。这种温度响应性是由于温敏性吸附介质中存在亲水性基团和疏水性基团所致，梯度洗脱时，这些基团可与有机分子形成氢键、范德华作用力，吸附介质对有机物有超分子作用和包合作用。当固相微萃取柱小于30℃时，吸附介质中的分子链在流动相中以自由伸展的构象存在，其亲水性基团与有机污染物分子形成分子间氢键，使在一定时间内不能将其洗脱完全；固相微萃取柱温度高于40℃时，分子链收缩成球形结构，亲水性的基团与有机污染物分子所形成的氢键断裂，疏水基团起主导作用，因此在该时间内，有机污染物分子从固相微萃取柱中完全洗脱出来。也因此选定在室温时对酚类污染物进行吸附，高温时进行解吸附。

三.检测方法的准确性与精密度

标准曲线：配制一系列浓度的5个标准样品，5个标准样品与上述检测方法的可行性中所述的5个标准样品相同，以1.0ng/ml的流速富集30min，纵坐标y为峰面积，横坐标x为浓度；以峰面积对浓度作标准曲线，得到5个标准样品的标准曲线分别如下：y1=55.05x1-0.49；y2=497.88x2-37.84；y3=76.25x3+5.67；y4=50.29x4-8.59；y5=52.31x5+3.89。线性范围分别为：1号样品pnp：1~500ng/ml；其余4种均为0.2~500ng/ml。

采用加标法对回收率进行研究，取同种水样作为样品基质，添加2个不同浓度的酚类标准样品，酚类标准样品同上述5个标准样品，标准样品的浓度分别为0.50ng/ml，5.0ng/ml相同条件下富集该水样，平行测定3次，所得峰面积带入标准曲线得检测浓度，然后计算其回收率和精密度。色谱图分别见图8、图9和图10，计算回收率和精密度，结果见表1。

表1回收率和精密度的计算结果（%）

由表1可知，回收率为87.7~106.7%，精密度为0.194~4.55%。