用于脂质化合物检测的微流控芯片和脂质化合物的检测方法与流程

本发明属于物质检测分析领域，具体涉及一种用于脂质化合物检测的微流控芯片和脂质化合物的质谱分析方法。

背景技术：

微流控技术是由微通道和微结构组成的具有功能性和完成特定任务的微流体系技术。微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程中的样品制备、反应、分离检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上。具有液体流动可控、样品处理时间短、试样消耗少并可规模集成等优势，在多种化学反应或检测领域发挥着独特的用途。

质谱作为一种免标记、分子特异性、灵敏的通用分析方法，被广泛地应用于生物分析的各个领域。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrometry,maldi-tof-ms)等软电离技术的出现使得生物大分子电离产生气相离子成为可能,使得质谱在测定复杂的生物样品领域得到了广泛的应用。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱具有分析速度快、样品前处理简单、质量范围宽以及适合分析复杂样品的优点，目前已被广泛地用于测量多肽、蛋白质、核酸等生物大分子的分子量以及高分子聚合物的分子量分布。

目前，微流控芯片在质谱相关检测技术中的应用以及黑磷与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的结合也得到了众多研究者的关注，其基础和应用已成为研究热点。

现有的微流控与质谱联用技术多用于细胞代谢等方面的检测，同时技术中出现的质谱并非能适用于大分子分析的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。此外，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱常用的有机基质如α-腈基-4-羟基肉桂酸，2,5-二羟基苯甲酸及芥子酸在小分子区域的干扰比较大。

脂质组学作为代谢组学的重要分支，其研究对象为生物体的所有脂质分子，主要表征生物体受到扰动后脂质代谢的变化以及介导信号转导的变化。作为一类重要的代谢物，协调的脂质代谢是能量平衡、膜结构及其动态改变信号、转导、自噬等重要生命过程中不可或缺的环节，因此开发一种分析血液样品中多种脂质组分的方法是脂质组学分析的重要前提，相关研究结果将为后续健康效应和危害机制的研究提供重要参考信息。因此，对脂质化合物的研究与表征因此是十分重要的，脂质分子的分子量因为取代基的变化，跨度也十分大，找到一个能从较小分子量到较大分子量全系列脂质化合物精确表征的方法是十分重要的。

将现有的微流控与质谱联用技术用于脂类的研究是个好的思路，但是现有的基质产生的对小分子量的干扰依旧没有得到解决。因此找到一种基质材料，对现有的检测脂质化合物的芯片及脂质化合物的检测检测方法是十分有必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于检测脂质化合物的微流控芯片和脂质化合物的检测检测方法，以克服现有技术中对小分子量脂质化合物信噪比较小，无法精确表征的缺陷。

为了解决所述问题，本发明的一方面，提供了一种用于脂质化合物检测的微流控芯片。所述微流控芯片包括基片和与所述基片结合的盖片，所述盖片的与所述基片结合面上开设有若干彼此间隔的微槽，且若干彼此间隔的所述微槽与所述基片构成若干彼此间隔的微流道，至少在所述微流道区域内的基片表面上负载有黑磷基质材料。

优选地，所述黑磷基质材料单位面积的负载量为0.0012-0.002mg/mm²。

优选地，在所述微流道内壁上负载有黑磷基质材料的方法包括如下步骤：

将黑磷基质材料以不同转速离心处理后分散于乙醇和水的混合溶剂中，注入微流道中，待溶剂挥发完。

进一步优选地，所述多种转速的离心处理依次以3000rpm，6000rpm，9000rpm和12000rpm。

进一步优选地，所述乙醇和水的比例为1:1-4：6。

优选地，所述基片为单面布有ito涂层的玻片。

优选地，所述所述盖片的聚合物为聚二甲基硅氧烷。

优选地，所述微流道上均设有包括入液口和出液口。

本发明另一方面提供了一种检测脂质化合物的方法，包括如下步骤：

将经前期处理后的样品溶液注入本发明微流控芯片的微流道中，待溶剂挥发完，制备质谱分析样品；

去掉所述微流控芯片的所述盖片，将含有质谱分析样品的基片置于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱中进行分析，获得多种脂质的分析数据。

优选地，所述萃取用的溶剂为甲基叔丁基醚、氯仿、二氯甲烷、甲醇中的一种或多种。

相对于现有技术，本发明所述微流控芯片采用黑磷作为基质，当进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对脂质化合物的检测时，由于黑磷作为基质，这样，在小分子区就没有基质材料的质谱信号了，可以避免传统基质自我电离产生的信号干扰，而且黑磷本身与脂质物质具有良好的相容性。另一方面微流控技术，使得测试可以批量化，微型化，用更少的测试样品就可以完成。

本发明所述的脂质化合物的检测方法由于采用了本发明微流控芯片，测一方面试的稳定性也得到保证灵敏度、重现性、分辨率和信号抑制都得到很大改进。另一方面测试的效率，方便程度都得到不同程度的改善。

附图说明

图1是本发明实施例脂质化合物的检测方法对血清样品的非靶向的质谱数据；

图2是本发明实施例脂质化合物的检测方法获得的质谱数据进行脂质组分分析结果图；

图3是本发明实施例检测得出该脂质组分与基质不同对比的分析结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种微流控芯片。所述微流控芯片用于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对脂质化合物的检测，其包括基片和与所述基片结合的盖片。

其中，所述盖片的与所述基片结合面上开设有若干彼此间隔的微槽，且若干彼此间隔的所述微槽与所述基片构成若干彼此间隔的微流道，每条所述微流道上均设有入液口和出液口。设置的若干个微流道互相独立，可以同时检测多组数据。

所述盖片的材料包括聚合物为聚二甲基硅氧烷。当所述盖片的材料为聚二甲基硅氧烷时，所述聚二甲基硅氧烷盖片采用软刻蚀技术制作获得。具体可以是模板用三甲基氯硅烷(tmcs)熏10分钟，将rtv615的a组分(预塑体)与b组分(交联剂)以10：1比例混合均匀，倾倒至流体层模板上，真空抽气除泡，80℃烘箱加热40分钟固化后，将其从硅片上撕下，切割并打孔，从而获得与所述基片结合的表面上开设有若干彼此间隔微槽的所述聚二甲基硅氧烷盖片。其中，所述微槽可以是若干，如8个微槽，那么与基片结合后形成的所述微流道也对应有彼此间隔的8个微流道。每条微流道长31mm，宽0.2mm，通道上两个样品点间隔3.8mm。所选的尺寸是适应基片大小采取的正常选择。

所述微流控芯片所含的所述基片可以是微流控芯片常用的基片，如在一实施例中，所述基片为单面布有ito涂层的玻片。ito玻片是常用的基片，可根据测试仪器的型号选择基片的大小，有ito涂层的这面与盖片结合。

在上述各实施例中，在所述微流道内，具体的是至少在所述微流道区域内的基片表面上负载有黑磷基质材料。在一实施例中，负载黑磷之后小分子区域干扰信号明显减少。所述黑磷基质材料单位面积的负载量为0.0012-0.002mg/mm²，负载合适的量可以有效地和被测物接合形成共晶体。

在具体实施例中，所述黑磷基质材料是采用包括如下步骤的方法至少负载所述微流道区域内的基片表面上：

所述基质材料黑磷负载的方法为将黑磷以多种转速离心处理后散于乙醇和水的混合溶剂中，分散液注入微流道中，待溶剂挥发完。

其中，所述多种转速的离心处理可以包括依次以3000rpm，6000rpm，9000rpm和12000rpm的转速进行离心的步骤。优选的，每个转速离心处理的条件可以是于25℃条件下处理15分钟。处理后的黑磷达到此粒径后就可以轻易的分散，并取得良好的负载效果。

更具体的地，所述乙醇和水的比例为1:1。通过调整混合溶剂的比例达到最佳溶解度。

另一方面，本发明实施例提供了一种脂质化合物的检测方法，包括如下步骤：

s01：将处理的样品溶液注入所述微流控芯片的微流道中，待溶剂挥发完，制备质谱分析样品；

s02：去掉所述微流控芯片的所述盖片，将含有质谱分析样品的基片置于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱中进行分析，获得多种脂质的分析数据。

其中，步骤s01中所述萃取用的溶剂包括甲基叔丁基醚、氯仿、二氯甲烷、甲醇中的一种或多种。

在实际操作中是去掉盖片后将基片卡在靶架上进行测试。得到的数据为非靶向性数据，可以全系列的对被测样品进行数据采集分析。

本发明所述的用于检测脂质化合物的微流控芯片拓宽了黑磷作为基质利用质谱检测化合物的用途范围，也就是对脂质化合物进行检测。相比传统基质，一方面由于黑磷不会出信号，做到了在小分子量区间无干扰，对小分子区域的精确定量很有好处。另一方面是黑磷与脂质化合物良好的相容性。微流控芯片集成了质谱分析样品基片处理的步骤，并且由于其精细结构，使得检测样品的量被减到很小，并且设置的多个检测通道使得一次可以批量检测多个样品。

本发明所述的脂质化合物的检测方法采用黑磷作为基质的微流控芯片集成了质谱分析样品基片处理的步骤，并且由于其精细结构，使得检测样品的量被减到很小，并且设置的多个检测通道使得一次可以批量检测多个样品。并且由于黑磷的存在大大降低了小分子区域的信号干扰，提升了检测精度。总体技术效果是操作得到集成简化，测试数据更加精确灵敏，测试的操作更加简单连贯，而且测得数据可信度也更高。本发明的进步性十分显著。

以下通过多个具体实施例来举例说明利用本发明实施例微流控芯片和脂质化合物的检测方法。

实施例1

本实施例1提供了一种利用本发明实施例微流控芯片联用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对脂质化合物的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：

步骤1：提供上文所述的本发明实施例微流控芯片；

步骤2：将基质材料黑磷离心分离，去掉上清，用溶剂(乙醇/水)分散，利用微量注射器通注入微流控芯片的微流道，待溶剂挥发完全，即得到黑磷作为基质修饰的微流道；

步骤3：移取50～200μl的从人体获得的血清样品置于1.5ml的离心管中，加入500μl的甲基叔丁基醚溶液进行液液萃取10～15min，重复三次，收集的上层萃取液用氮吹仪浓缩至近干，复溶于50μl纯水中，获得分析样本；

步骤4：将步骤3)中处理好的分析样本通过微量注射器注入通过步骤2)中得到的微流控芯片中，待水挥发完，即完成分析样品制备。

步骤5将步骤4)中处理好的微流控芯片的聚合物盖片除去，将所述的基片卡在mtpslideadapterii靶架上送入maldi-tof/ms对其进行质谱分析，质谱全扫描范围为m/z140～1100da，正离子反射模式。激光激发源是355nm和2khz固态nd：yag/355nmsmartbeam激光器。如图1可以获得非靶向的质谱数据。

步骤6对步骤5)获得的质谱数据进行脂质组分分析，如图2可以在一条微流道上检测得出多种脂质组分。

实施例2

本实施例2提供了一种利用本发明实施例微流控芯片联用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对脂质化合物的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：

步骤1：提供上文所述的本发明实施例微流控芯片；

步骤2：将基质材料黑磷离心分离，去掉上清，用溶剂(乙醇/水)分散，利用微量注射器通注入微流控芯片的微流道，待溶剂挥发完全，即得到黑磷作为基质修饰的微流道；

步骤3：移取pc(17：0)的标准品溶解在氯仿中，获得浓度为100μg/ml的分析样本；

步骤4：将步骤3)中处理好的分析样本通过微量注射器注入通过步骤2)中得到的微流控芯片中，待溶剂挥发完，即完成分析样品制备。

步骤5将步骤4)中处理好的微流控芯片的聚合物盖片除去，将所述的基片卡在mtpslideadapterii靶架上送入maldi-tof/ms对其进行质谱分析，质谱全扫描范围为m/z140～1100da，正离子反射模式。激光激发源是355nm和2khz固态nd：yag/355nmsmartbeam激光器。可以获得非靶向的质谱数据。

步骤6对步骤5)获得的质谱数据进行脂质组分分析，如图3可以在一条微流道上检测得出该脂质组分与基质不同对比的分析结果。

经实验结果表明，采用此方法制作的黑磷作为maldi基质检测脂质化合物的方法可实现生物样品中多种脂质组分的检测。