串联配对柱化学性质用于高通量蛋白质组学外泌体分析的制作方法

文档序号:25540973发布日期:2021-06-18 20:36阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种方法,其包括:

(a)提供生物样品;

(b)针对循环微粒富集样品;

(c)使所述富集的样品经受颗粒破坏和蛋白水解消化以产生分析样品;

(d)将所述分析样品上样至捕获多肽的捕集柱上;

(e)从所述捕集柱清洗未捕获的材料;

(f)从所述捕集柱洗脱捕获的多肽,并将所述洗脱的多肽上样至与所述捕集柱流体连接的分析柱上;

(g)在所述分析柱上分离所述多肽;以及

(h)用检测器检测分离的多肽。

2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述生物样品包含血液、血清、血浆、唾液、脑脊髓液、羊水或尿液。

3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述生物样品是从患有选自怀孕、癌症、自发性早产、先兆子痫或糖尿病的病况的受试者中提供的。

4.根据权利要求1所述的方法,其中,通过尺寸排阻色谱法、超滤或反相色谱法中的一种或多种来富集所述生物样品中的微粒。

5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述循环微粒是外泌体。

6.根据权利要求1所述的方法,其中所述颗粒破坏包括:暴露于尿素、还原剂(诸如dtt、dte、巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦或谷胱甘肽)或碘乙酰胺中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的方法,其中蛋白水解消化包括:将所述样品暴露于溴化氰(cnbr)或一种或多种蛋白酶,诸如氨基肽酶、羧肽酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和蛋白酶k。

8.根据权利要求1所述的方法,其包括向所述分析样品中添加用于检测特定蛋白质标志物的稳定同位素标准品肽。

9.根据权利要求1所述的方法,其中,所述捕集柱进行选自反相色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱或尺寸排阻色谱的色谱法,或者为聚苯乙烯-二乙烯基苯柱。

10.根据权利要求1所述的方法,其中,所述捕集柱包含高效液相色谱(hplc)柱。

11.根据权利要求10所述的方法,其中,所述hplc柱包含选自c18或c6的反相材料。

12.根据权利要求1所述的方法,其中步骤(e)中的未捕获的材料包含选自盐和大分子或复合物的材料,所述复合物的大小大于5.5kd,或者所述大分子是大于约50个氨基酸长的多肽。

13.根据权利要求1所述的方法,其中,所述分析柱包含高效液相色谱(hplc)柱。

14.根据权利要求13所述的方法,其中所述hplc柱包含选自c18或c6的反相材料。

15.根据权利要求1所述的方法,其中,所述捕集柱与所述分析柱之间的流体连接包含第一流体导管和第二流体导管,在它们之间设置有多通阀。

16.根据权利要求1所述的方法,其中,检测包括通过所述分析柱与所述检测器之间的流体连接将分离的分析物提供给所述检测器。

17.根据权利要求1所述的方法,其中,所述检测器通过质谱法检测分析物。

18.根据权利要求1所述的方法,其中,所述检测器包含:选自四极杆质谱仪或飞行时间质谱仪的质谱仪。

19.根据权利要求1所述的方法,其中,所述检测器包含串联质谱仪。

20.根据权利要求1所述的方法,其中,所述检测器包含三重四极杆质谱仪。

21.根据权利要求1所述的方法,其中,所述检测器包含三重四极杆质谱仪,并且所述检测包含多重反应监测。

22.一种系统,其包含:

(a)捕集柱;

(b)通过第一流体导管连接到所述捕集柱的多通阀;以及

(c)通过第二流体导管连接到所述多通阀的分析柱。

23.根据权利要求22所述的系统,其中,所述捕集柱上样有针对循环微粒富集的样品,其中,所述样品已经经受了颗粒破坏和蛋白水解消化。

24.根据权利要求22所述的系统,其中,所述捕集柱还包含稳定同位素标准品多肽。

25.根据权利要求22所述的系统,其还包含:

出口流体导管,其将出口端口连接到所述多通阀。

26.根据权利要求22所述的系统,其还包含:

检测器,其通过检测器流体导管连接到所述分析柱。

27.根据权利要求22所述的系统,其还包含:

泵,其中所述泵通过泵流体导管连接到所述捕集柱。

28.根据权利要求22所述的系统,其中,所述捕集柱选自反相色谱柱、阴离子交换色谱柱、阳离子交换色谱柱、聚苯乙烯-二乙烯基苯柱或尺寸排阻柱。

29.根据权利要求22所述的系统,其中,所述捕集柱包含高效液相色谱(hplc)柱。

30.根据权利要求28所述的系统,其中,所述hplc柱包含选自c18或c6的反相材料。

31.根据权利要求22所述的系统,其中,所述分析柱包含高效液相色谱(hplc)柱。

32.根据权利要求26所述的系统,其中,所述检测器包含质谱仪。

33.根据权利要求26所述的系统,其中,所述检测器是选自四极杆质谱仪或飞行时间质谱仪的质谱仪。

34.根据权利要求26所述的系统,其中,所述检测器包含串联质谱仪。

35.根据权利要求26所述的系统,其中,所述检测器包含三重四极杆质谱仪。

36.根据权利要求22所述的系统,其中,所述循环微粒是外泌体。

37.一种方法,其包括:

(a)提供一种系统,其包含:

(i)捕集柱;

(ii)通过第一流体导管连接到所述捕集柱的多通阀;

(iii)通过第二流体导管连接到所述多通阀的分析柱;

(iv)通过出口流体导管连接到所述多通阀的出口端口;以及

(v)通过检测器流体导管连接到所述分析柱的检测器;

(b)使所述捕集柱上样有样品,该样品包含一种或多种分子,所述分子选自多肽、复合碳水化合物、核酸以及复合脂质,以使流过物通过所述第一流体导管、所述多通阀、以及第三流体导管;

(c)清洗所述捕集柱,以使清洗液通过所述第一流体导管、所述多通阀和所述第三流体导管;

(d)洗脱所述捕集柱,以使洗脱液通过所述第一流体导管、所述多通阀和所述第二流体导管进入所述分析柱;

(e)在所述分析柱上分离所述洗脱液的组分;

(f)使步骤(d)中分离出的组分通过第四流体导管到达所述检测器;以及

(g)检测一种或多种分离的组分。

38.根据权利要求37所述的方法,其中,检测包括质谱法。

39.根据权利要求38所述的方法,其中,质谱法包含多重反应监测质谱法。

40.权利要求37所述的方法,其中步骤(a)的样品包含约1μg至约5μg的蛋白质或肽。

41.根据权利要求37所述的方法,其中所述样品包含已经经受蛋白水解处理的破坏的外泌体。

42.根据权利要求37所述的方法,其中所述样品包含选自多肽、复合碳水化合物、核酸和复合脂质的多种分子。

43.根据权利要求37或42所述的方法,其中,所述样品还包含盐。

44.根据权利要求37所述的方法,其中,所述样品包含细胞匀浆或组织匀浆。

45.根据权利要求37所述的方法,其中所述样品包含多肽、脂质和盐。

46.根据权利要求45所述的方法,其中,所述样品还包含核酸和/或复合碳水化合物。

47.根据权利要求45所述的方法,其中,所述样品还包含金属。


技术总结
本申请提供了用于从生物样品获得的肽样品的样品制备和质谱分析的组合物和方法。所述组合物和方法包括串联柱系统,其中捕集柱与分析柱诸如例如HPLC柱流体接触。当分析物从所述分析柱洗脱时,它们可以被传递至检测器(例如,质谱仪)进行肽分析。

技术研发人员:K·P·罗森布拉特;N·哈贾;M·哈立德
受保护的技术使用者:NX产前公司
技术研发日:2019.11.09
技术公布日:2021.06.18
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