水稻成熟种子糊粉层分离方法与流程

本发明涉及水稻种子组织分离领域，具体涉及一种水稻成熟种子糊粉层分离方法。

背景技术：

现有的糊粉层分离方法主要包括以下几种方式：

1、人工分离糊粉层

由于糊粉层与种皮紧密结合，很难从麸皮中分离出来。目前已经发展了许多不同的分离方法，从满足实验室生化分析的小规模技术，到适合大规模糊粉层生产的半工业化工艺。在实验室研究，人工分离全谷物是获得纯净样品的较好的方法。分离干谷物籽粒时需要浸水后，种子大部分组织都可以分离(barronetal.2007)。还有其它浸提麸皮的方法，如浸提剂和有机溶剂浸提等(brounsetal.2012)。而这种方法受到了时间和劳动力限制不能量化，且费时费工，不适用于工业化生产。

2、机械分离方法

由于糊粉层的营养特性非常重要，为了大规模分离糊粉层，开发了新的湿分离和干分离工艺。kvistetal.(2010)发明了一种湿法分离工艺，它结合了几种酶处理和湿法磨粉步骤，顺序离心后超滤。与湿法分离法不同，干分离法只需要物理/机械过程，防止糊粉层细胞结构的生化变化。在干分离过程中，首先将各种麸皮组织进行研磨分离，根据颗粒的大小、质量、密度、静电等特性对其进行分类，提高糊粉层的纯度(hemeryetal.2009)。

首先清除小麦籽粒表面的杂物，浸水5分钟后的小麦放入小麦精米机去掉表皮，然后清除籽粒表面的杂物后再次浸水，最后将小麦籽粒放入小麦精米机中，采用原装磨辊就可以成功分离小麦糊粉层(田丰贺2012)。

该方法可以用于食品工业分离大量糊粉层，但是对于实验室所需少量糊粉层，用于糊粉层功能等方面的研究，则不太适用。

2.1.2.2分离少量糊粉层

galland等(2014)选取100粒籽粒饱满、没有病虫害侵蚀的种子，经过砻谷机去除谷壳后获得糙米，将其放入jmnj-3小型精米机中研磨15分钟后半薄切片显示，研磨15分钟后种子无糊粉层结构。

该方法的缺点是耗时较长，而且获得的糊粉层量极少且未定量。

3.激光显微分离技术

在水稻籽粒发育前期，糊粉层细胞和淀粉胚乳在结构上连接紧密，籽粒发育初期比较柔软，手工和机械分离糊粉层与胚乳细胞是非常困难的。ishimaru等(2007)将早期发育的颖果用丙酮或者乙醇醋酸溶液作为固定剂，采用羧甲基纤维素或石蜡作为包埋剂。利用激光显微切片技术可以精确分离发育初期的胚乳细胞和糊粉层细胞，可以获得高质量完整性的rna。

该方法的缺点是对仪器设备以及操作人员的技术要求均较高，并且成熟种子糊粉层分离较难且每次获得量很少，操作技术和环境要求严格。

现有分离技术的缺点

1人工分离方法受到了时间和劳动力限制不能量化，且费时费工，不适用于工业化生产。

2现有小麦籽粒糊粉层分离技术研究比较多，分离技术相对成熟，但是分离小麦糊粉层需要浸水过程容易导致糊粉层细胞生理生化反应发生改变，吸水后的细胞放入超低温保存细胞容易胀破。

3工业所用方法可以用于大样本量的样品，例如食品工业分离大量糊粉层，但是对于实验室所需少量糊粉层，用于糊粉层功能等方面的研究，则不太适用。

4有的实验室所用的分离少量糊粉层的方法耗时较长，而且获得的糊粉层量极少且未定量，无法满足对于功能分析需要定量这一要求。

5利用激光显微解剖仪器分离发育初期颖果中糊粉层细胞，可得到纯度高的糊粉层，但对成熟种子糊粉层分离较难且每次获得量很少，糊粉层细胞rna易降解，操作技术和环境要求严格。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种水稻成熟种子糊粉层分离方法。

水稻成熟种子糊粉层分离方法，包括以下步骤：

步骤1、将糙米去胚后放入小型精米机中研磨；

步骤2、研磨15s后收集粉末状物质，即为糊粉层。

进一步的，步骤1中，需将糙米装满仪器进料斗。

进一步的，所述小型精米机的型号为2199、3099、9099、2008、2299、3300、ltjm-2099、ljjm-2011、ltjm-2088、sxjmj-2088、rm369、ltjm-169、ltjm-850、sxjmj-858、jmnj-3或ljjm-2011。

本发明的有益效果为：本发明的方法利用实验室研磨压力和研磨速度固定且相同的普通小型精米机，通过研磨15s即可快速分离水稻糊粉层，研磨得到的糊粉层很容易收集且可以定量，方法简单容易操作，分离产物不含有胚的干扰。

附图说明

图1为粳稻(nip)和籼稻(zs97)利用实验室普通小型精米机jmnj-3分别研磨0s、10s、15s、25s和50s的种子颜色比较；

图2为zs97种子横切后，利用实验室普通小型精米机jmnj-3研磨不同时间的糊粉层结构伊文思蓝染色图；

图3为采用本发明的方法分离后的水稻种子的胚(a)、胚乳(b)、糊粉层(h)、谷壳(c)四种组织的代谢物主成分分析图；

图4为采用本发明的方法分离后的水稻种子的胚(em)、胚乳(ed)、糊粉层(al)三种组织的脂肪酸含量主成分分析图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

选取饱满、没有病虫害侵蚀的完整的水稻种子，用砻谷机去壳并进行人工去胚后，将其放入实验室普通小型精米机中，jmnj-3、ljjm-2011、rm-369等型号均可，这些型号的精米机的研磨压力和研磨速度均固定且相同，在此我们以jmnj-3小型精米机为例。

将去胚后的糙米装满仪器进料斗，研磨不同时间。根据实验结果，籼稻zs97种子为840粒，而粳稻nip种子为1040粒能够装满仪器进料斗。如图1所示，将种子分别研磨0秒(s)、10s、15s、25s和50s，发现研磨15s后种子颜色几乎完全变白。通过伊文思蓝染色后，观察研磨15s后种子仍然有薄薄一层糊粉层结构，研磨25s后糊粉层几乎不存在，为避免收集的粉末中混有胚乳，因此选择研磨15s时收集粉末状物质，即为糊粉层。如图2所示为zs97种子横切后，研磨不同时间的糊粉层结构伊文思蓝染色效果图(图中蓝色被替换为了黑色)，由图2可看出，胚乳被染色为深蓝色(图中为深黑色)，糊粉层被染色为外缘浅蓝色层(图中为浅黑色)。箭头所指的种子边缘层即为糊粉层。

由于籼稻和粳稻粒型的区别，装满进料斗所需种子量有所不同，因此本实验选取代表性品种，籼稻zhenshan97b(zs97)和粳稻nipponbare(nip)进行实验。zs97选取840粒完整的种子，用砻谷机去壳并进行人工去胚后，即可装满仪器进料斗，研磨15s后，分离糊粉层的量约970mg。而粳稻nip选取1040粒完整的种子，用砻谷机去壳并进行人工去胚后，即可装满仪器进料斗，研磨15s后，分离糊粉层的量约为805mg。分离的糊粉层粉末易收集。

水稻种子糊粉层分离效果分析

1)利用次级代谢物进行分离效果分析

从一套水稻粳稻nipponbare(nip)和籼稻zhenshan97(zs97)构成的染色体代换系(cssl)中随机选择5份材料，与背景材料zs97，一共六份材料,每种材料选择三份作为对比，一共18份材料，用于分析水稻种子糊粉层的分离效果。我们将每份材料分离成胚、胚乳、糊粉层、谷壳四种组织，即每个组织18个样品，对所有样品进行水稻种子已鉴定出来261种代谢物主成分分析(pca)，如图3所示，图3中，a代表胚，b代表胚乳，c代表壳，h代表糊粉层，从图3中可以看出每个组织的18个样品聚集在一起，说明四个组织可以被很好的分离开。说明组织之间的区别远远大于一个组织不同样品之间的区别，即说明我们的组织分离方法是有效的，从代谢物的角度说明四个组织的代谢物是有明显区别的。图中pc1解释了34.3％的变异率，pc2解释了23.5％的变异率。

成熟的水稻种子的不同部位代谢物含量上存在显著性的差异，也反应了分离糊粉层的方法的有效性。特别是胚乳和糊粉层聚类显著分离，说明我们的分离方法能够很好的将胚乳和糊粉层分离开。

2)利用脂肪酸含量进行分离效果分析

还是从一套水稻粳稻nipponbare(nip)和籼稻zhenshan97(zs97)构成的染色体代换系(cssl)中随机选择5份材料，与背景材料zs97，一共六份材料,每种材料选择三份作为对比，一共18份材料，我们将18份水稻种子材料分离成胚、胚乳和糊粉层三种组织，即每个组织有18个样品，分别对三种组织的18个样品的各类脂肪酸含量进行主成分分析(pca)，如图4所示，图4中，al代表糊粉层，em代表胚，ed代表胚乳，结果表明水稻种子胚、糊粉层和胚乳中脂肪酸含量存在显著的差异。从含量上可看出，脂肪酸主要富集在水稻种子的胚和糊粉层中。从图4中可以看出每个组织的18个样品聚集在一起，说明三种组织可以被很好的分离开，也可以说明我们的组织分离方法是有效的。图中pc1解释了99.2％的变异率，pc2解释了0.6％的变异率。

以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。