本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种制备血清中定值梅毒特异性抗体的方法，尤其是涉及一种梅毒特异性抗体免疫亲和柱及配基。
背景技术：
梅毒(syphilis)是由苍白密螺旋体苍白亚种(treponemapallidumsubsppallidum，tp)感染引起的慢性全身性性传播疾病。梅毒的表现千变万化，主要表现为生殖器部位的红斑、破溃，个别人会出现全身的皮疹，一般没有明显的症状。一期梅毒标志性的临床特征是硬下疳，好发的部位是阴茎、龟头、冠状沟、包皮、尿道口、大小阴唇、阴蒂宫颈等等，也可以在肛门、肛管，还有一些患者可以在口唇、舌头、乳房等这些性接触的部位。未得到治疗的患者，一般于感染后6周至6个月可发生二期梅毒。是由于一期梅毒硬下疳内的梅毒螺旋体经淋巴管到达淋巴结后，通过血液循环播散全身所致。早期可有发热、疲倦、头痛、喉痛、肌肉痛、关节痛、厌食等全身症状。半数以上患者有全身淋巴结肿大，偶有肝脾肿大。血像可有白细胞增多，贫血和血沉升高等。
近年来梅毒发病率有上升趋势，其传染性与危害性大，早期诊断、及时治疗已成为当前梅毒治疗中最为重要的问题。为了控制梅毒的院内感染，卫生部已规定凡是手术、输血及各种创伤性检查的患者，均需进行梅毒特异性抗体的血清学检测。血清学诊断是梅毒诊断(特别是晚期和潜伏期梅毒的诊断)的重要手段。选择敏感性、特异性高的血清学实验方法无论是对梅毒的诊断、治疗、预防，还是对血液制品的梅毒筛查都十分重要。
在实验室中临床梅毒检测过程中，质控品是保证室内质量工作的重要物质基础,而目前国内临床实验室免疫定性分析的质控品主要来自国外进口,存在项目单一且价格昂贵的问题,让中小型医院的实验室望而却步,在基层实验室推广困难。
梅毒特异性抗体定值血清母液来源主要是来源于梅毒阳性病人血清，但由于临床收集血清较难，而很多梅毒阳性病人血清合并有乙肝、丙肝或艾滋病病毒等病原体抗体，不能满足质控定值血清配制和生物安全的需要。因此，开发一种生物安全性高、抗体效价高血清中定值梅毒特异性抗体尤为重要。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种制备生物安全性高、抗体效价高血清中定值梅毒特异性抗体的方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种梅毒特异性抗体免疫亲和柱的配基，由梅毒螺旋体tp47、tp15、tp17蛋白融合而成。
tp47、tp15、tp17三个梅毒螺旋体蛋白可以以不同顺序组合成不同融合片段。
在一些实施方案中，本发明所述梅毒特异性抗体免疫亲和柱的配基，其氨基酸序列如seqidno.4所示。
本领域技术人员可以采用基因工程技术制备上述免疫亲和配基，如构建tp47、tp15和tp17重组基因表达载体，转化宿主细胞后诱导表达tp47、tp15和tp17融合蛋白。
其中，所述表达载体包括但不限于pgex-4t-3、pet28a、pet30a。所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。
本发明还提供了一种梅毒特异性抗体免疫亲和柱，所述免疫亲和柱的亲和层析填料偶联有上述带有亲和标签的配基。
其中，所述亲和标签包括但不限于his标签、gst标签、生物素标签或flag标签。在一些具体实施方案中，所述亲和标签为gst标签。
本发明所述的免疫亲和柱中，所述亲和层析填料为cnbr/nhs/环氧/巯基活化琼脂糖或葡聚糖凝胶。在一些具体实施方案中，所述亲和层析填料为nhs-sepharose4ff琼脂糖活化填料。
本发明还提供了所述梅毒特异性抗体免疫亲和柱的制备方法，具体为先将亲和层析填料活化，然后与上述的带有亲和标签的配基偶联，之后封闭得到梅毒特异性抗体免疫亲和柱。
本发明还提供了一种制备血清中定值梅毒特异性抗体的方法，先将梅毒阳性血清进行辛酸沉淀，收集上清，然后利用上述梅毒特异性抗体免疫亲和柱进行梅毒特异性抗体免疫亲和柱进行免疫亲和层析。
在本发明中，所述梅毒阳性血清包括但不限于人梅毒抗体阳性血清、羊梅毒抗体阳性血清或兔梅毒抗体阳性血清。
在一些实施方案中，本发明所述的方法中，所述辛酸沉淀具体包括以下步骤：
1)将梅毒阳性血清经冷冻离心收集上清，得到组分a；
2)组分a添加ph4.4醋酸钠至浓度为10-25mg/ml，得到组分b；
3)组分b加入辛酸至3-30μl/ml，离心收集上清。
在一些实施方案中，所述离心为15000rpm4℃离心15min。
在一些实施方案中，所述醋酸钠调节浓度为15-18mg/ml。
在一些实施方案中，所述组分b加入辛酸至25μl/ml。
进一步的，所述免疫亲和层析具体为经辛酸沉淀后的上清用上述梅毒特异性抗体免疫亲和柱进行纯化，收集洗脱液，调节ph至中性。
其中，所述洗脱液为0.2m甘氨酸、0.15mnaclph2.3-3.0。
在一些实施方案中，用氢氧化钠或tris-hcl调节ph至中性。在一些实施例中，所述tris-hcl为1mtris-hclph8.5。
有上述技术方案可知，本发明提供了一种梅毒特异性抗体免疫亲和柱的配基、梅毒特异性抗体免疫亲和柱及制备血清中定值梅毒特异性抗体的方法。本发明所述梅毒特异性抗体免疫亲和柱的配基，由梅毒螺旋体tp47、tp15、tp17蛋白融合而成。进一步通过填料偶联技术将活化填料和配基进行层偶联，得到梅毒特异性抗体免疫亲和柱。本发明利用辛酸沉淀与免疫亲和层析法相结合纯化血清中梅毒特异性抗体制备血清中定值梅毒特异性抗体。本发明所述制备方法制得的血清中定值梅毒特异性抗体生物安全性高、抗体效价高，有效除去甲肝、乙肝、丙肝、戊肝、艾滋等抗体交叉干扰，可作为体外诊断质控品，用于生物行业及医学检测行业领域的体外诊断。
具体实施方式
本发明公开了一种制备血清中定值梅毒特异性抗体的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，所述梅毒特异性抗体免疫亲和柱制备具体包括以下步骤：
1)活化：取亲和层析介质，加入hcl洗涤填料，再用超纯水洗涤；然后用偶联缓冲液洗涤；
2)偶联：将纯化后的融合抗原加入活化的亲和层析介质中在室温条件下偶联4小时，将偶联后的填料洗涤，得到偶联有融合抗原的亲和层析介质；
3)封闭：加入乙醇胺终止交联，并用乙醇胺封闭4h，然后洗涤，得到tp-亲和层析介质。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。如无特殊说明，本发明所述检测的实验仪器均为安图磁微粒发光仪。
实施例1：免疫亲和柱配基制备
利用核苷酸法编辑出带有gst标签的融合tp47、tp15和tp17多肽，并利用gst标签采用基因工程法利用大肠杆菌表达出融合tp47、tp15和tp17多肽的融合蛋白作为抗原，进行发酵，然后对发酵菌进行菌体破碎后抗原纯化，得到的融合蛋白抗原作为免疫亲和填料配基。其中，tp47、tp15和tp17多肽的氨基酸序列分别如seqidno.1-3所示。
tp47、tp15和tp17融合蛋白(氨基酸序列如seqidno.4所示)重组抗原的制备具体包括如下步骤：
1、构建tp47、tp15和tp17依次连接的重组基因表达载体，将所述重组基因表达载体转化到大肠杆菌中，对大肠杆菌进行诱导表达，并收集发酵后菌体；所述表达载体为pgex-4t-3；
2、破碎菌体，通过落地式高速离心机对破碎后菌体进行固液分离，并收集离心上清；对离心上清进行硫酸铵分级沉淀，通过sds-page检测融合蛋白沉淀组分，并用缓冲液重新溶解，得到融合抗原粗产物。
3、利用gst亲和层析柱纯化所述粗产物，及离子交换纯化，得到高纯度融合抗原，将纯化后融合抗原用含0.1mnahco3、0.5mnaclph8.3的水溶液透析，待用。
实施例2：免疫亲和层析柱制备
梅毒特异性抗体免疫亲和柱制备包括以下步骤：
1)活化：取10mlnhs-sepharose4ff琼脂糖凝胶亲和层析介质，加入2倍体积1mmhcl洗涤填料，洗涤三次；再用超纯水洗涤三次；然后用偶联缓冲液(0.1mnahco3、0.5mnaclph8.3)洗涤三次。
2)偶联：将实施例1纯化后的融合抗原加入nhs-sepharose4ff中，在室温条件下偶联4小时，将偶联后的填料用0.02mmpbsph7.4洗涤3次，得到偶联有融合抗原的琼脂糖凝胶sepharose4ff；
3)封闭：加入两倍体积1m乙醇胺ph7.4终止交联，并用1m乙醇胺ph7.4封闭4h，然后用0.02mtris-hclph8.0和0.1m醋酸钠ph4.0交替洗涤各三次。最后用超纯水洗涤三次，得到tp-sepharose4ff。
实施例3：血清中制备定值梅毒特异性抗体纯化
将梅毒阳性血清经冷冻离心机15000rpm4℃离心15min，保留上清，得到组分a。
组分a用紫外分光光度计检测浓度后，加入60mm醋酸钠ph4.4，调节浓度为15-18mg/ml，根据60mm醋酸钠ph4.4加入量，用0.5mnaoh或4m盐酸调节组分a得ph为4.4-4.6之间，得到组分b。
组分b加入辛酸至25μl/ml，搅拌30min后，以15000rpm4℃离心15min，上清液用筛网过滤后得组分c。
组分c调节ph至7.4，用0.45μm滤器过滤后用偶联后的tp-sepharose4ff层析柱纯化。平衡缓冲液为0.02mpbsph7.4，洗脱缓冲液为0.2m甘氨酸、0.15mnaclph2.7。收集洗脱液，并用1mtris-hclph8.5调节ph至中性得组分d。
然后用中空纤维柱洗滤换液至0.02mpbsph7.4。
用梅毒试剂盒检测组分d的s/co效价值，然后浓缩至所需要s/co值，用0.22μm针头滤器除菌过滤后，加1‰p300、-20℃保存。
根据以上实施方式操作，分别对两批次梅毒阳性血清进行纯化，比较所制备定值梅毒特异性抗体制备前和制备后的s/co值，结果见表1和表2。
表1第一批梅毒阳性血清制备前后s/co效价值
表2第二批梅毒阳性血清制备前后s/co值
结果显示，本发明所述纯化方法血清定值梅毒特异性抗体收率较高，定值梅毒特异性抗体收率可达80％以上。
进一步对所制备定值梅毒特异性抗体稳定性进行检测，结果见表3。
表3定值梅毒特异性抗体的稳定性检测
结果显示，所述纯化方法得到的定值梅毒特异性抗体稳定性较好。
对所制备定值梅毒特异性抗体去除交叉效果进行检测，结果见表4。
表4定值梅毒特异性抗体去除交叉效果
结果显示，所纯化方法能有效除去丙肝、艾滋、乙肝等阳性抗体，并有效富集梅毒抗体。
进一步根据上述纯化操作对梅毒阳性血清进行纯化制得梅毒特异性质控定值血清，与现有两种厂家定值血清数据比较，结果见表5。
表5s/co效价值
结果显示，与现有厂商的定值血清比较，本发明通过免疫亲和制备的梅毒特异性质控定值血清交叉项去除效果更优。
序列表
<110>郑州伊美诺生物技术有限公司
<120>一种制备血清中定值梅毒特异性抗体的方法
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