一种镍螯合磁性纳米颗粒、制备方法及用于分离纯化组氨酸标签蛋白的用途

本发明属于材料领域，涉及新材料的制备和应用，具体涉及一种镍螯合磁性纳米颗粒、制备方法及用于分离纯化组氨酸标签蛋白的用途。

背景技术：

利用基因工程技术生产各种重组蛋白成为蛋白类药物制备的一种重要手段，高纯度重组蛋白的获得离不开有效的分离纯化技术，其一般依赖各种蛋白质标签与固体树脂上的金属离子螯合来实现。其中，最常见的亲和标签是组氨酸标签，它可以与固定的镍离子或钴离子配位结合实现蛋白质分离。组氨酸标签重组蛋白常规的分离方法是利用含镍配合物树脂材料作为吸附剂进行分离纯化，但该种以树脂为基质的固定金属亲和色谱纯化步骤繁琐，耗时耗力，不同螯合配体和基质的选择成为蛋白质纯化研究的热点。

近年来，磁性纳米材料被广泛应用于蛋白质分离纯化领域，与固定金属亲和色谱法相比，该种方法避免了沉淀、超滤、离心等操作，利用外部磁场可直接从粗样品中分离目标蛋白，大大简化操作，并节约时间和经济成本。当磁性纳米材料用于组氨酸标签蛋白纯化时，需对磁性纳米材料表面进行化学修饰，螯合过渡金属离子，以达分离纯化组氨酸标签蛋白质的目的，现有方法制备的表面修饰磁性纳米粒子能实现有效组氨酸标签蛋白的分离，但磁性纳米颗粒表面修饰的过程较为复杂、操作繁琐，且经过多步修饰后有可能使修饰的小分子或者螯合上的镍离子脱落。此外，常用的修饰配体通常价格昂贵，因此，迫切需要开发新的简单高效的基于磁性纳米材料的组氨酸标签蛋白的纯化方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种镍螯合磁性纳米颗粒、制备方法及用于分离纯化组氨酸标签蛋白的用途。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种镍螯合磁性纳米颗粒，为一种螯合镍的酒石酸氢钠修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒(镍-sb磁性纳米颗粒)。

一种上述镍螯合磁性纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)：采用共沉淀法制备获得四氧化三铁磁性纳米粒子，与酒石酸氢钠常温超声反应获得酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒；然后将上述磁性纳米颗粒分散于去离子水中，逐滴加入naoh溶液，使溶液的ph达到9.0-10.0之间，以保证磁性颗粒表面的羧酸根呈羧酸盐状态，磁分离，除去naoh溶液；最后用去离子水洗涤，保存于水溶液中；

步骤(2)：将上述经过naoh处理的磁性纳米颗粒溶液加入niso4溶液中，超声反应，反应结束后进行磁分离，沉淀用去离子水洗涤，以去除多余的niso4，最终得到螯合镍的酒石酸氢钠修饰的四氧化三铁纳米颗粒。

优选地，naoh溶液的浓度为0.10moll^-1。

优选地，niso4溶液的浓度为10mgml^-1。

优选地，步骤(2)超声反应4h。

上述镍螯合磁性纳米颗粒用于分离纯化组氨酸标签蛋白的用途。

优选地，所述用途的应用方法包括如下步骤：

步骤(1)：将表达六个组氨酸标签的重组蛋白的大肠杆菌经异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷诱导表达后，收集菌液，加入蛋白提取裂解液后进行超声破碎，高速离心后取上清即为大肠杆菌总蛋白溶液；

步骤(2)：将镍螯合磁性纳米颗粒加入细菌总蛋白溶液，重悬纳米颗粒，于4℃旋转结合1h，磁分离，上清为磁性材料吸附后的上清溶液；

步骤(3)：将步骤(2)获得的吸附蛋白的磁性颗粒用50×咪唑溶液震荡洗涤10min，磁分离，弃上清，重复洗涤3次，以洗脱未吸附的蛋白；

步骤(4)：在步骤(3)得到的磁性材料中加入250×咪唑溶液，旋转洗脱10min，磁分离后的上清即为分离纯化后的组氨酸标签重组蛋白。

有益效果：

(1)本发明所制备的镍-sb磁性纳米颗粒，修饰反应简单，通过一步反应获得酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒。

(2)酒石酸氢钠修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒通过表面的羧酸根离子可固定结合大量镍离子，成功实现从复杂的大肠杆菌总蛋白裂解液中高效、特异分离纯化不同分子量大小的组氨酸标签重组蛋白，从复杂细菌裂解液样品中分离组氨酸标签蛋白能力高，最大结合能力为556mg蛋白/g磁性材料，高于商品化的磁珠(<20mgg^-1)和目前已知的文献报道的镍螯合的磁性纳米材料(测定方法见实施例3)，具体比较如下表所示：

(3)分离纯化过程简便，本发明制备的镍-sb磁性纳米颗粒表面固定的镍不易脱落，重复使用率高。

附图说明

图1是本发明制备的镍-sb磁性纳米颗粒的tem图。

图2是镍-sb磁性纳米颗粒的xps图。

图3是镍-sb磁性纳米颗粒从复杂的大肠杆菌裂解液中分离纯化组氨酸标签的人碳酸酐酶重组蛋白的蛋白电泳图。泳道m为蛋白marker，1为分离前细菌裂解液中总蛋白，2为磁性材料吸附后的上清溶液，3为洗脱的组氨酸标签蛋白条带。

图4是镍-sb磁性纳米颗粒从复杂的大肠杆菌裂解液中分离纯化组氨酸标签人pin1重组蛋白的蛋白电泳图。泳道m为蛋白marker，1为分离前细菌裂解液中总蛋白，2为磁性材料吸附后的上清溶液，3为洗脱的组氨酸标签蛋白条带。

图5是镍-sb磁性纳米颗粒重复利用1-6次从复杂的大肠杆菌裂解液中分离组氨酸标签重组蛋白的蛋白电泳图，其中泳道m为蛋白marker，1为分离前细菌裂解液中总蛋白，2-7依次为镍-sb磁性纳米颗粒重复使用1-6次分离的组氨酸标签蛋白条带。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1镍-sb磁性纳米颗粒的制备

制备方法包括如下步骤：

(1)采用共沉淀法制备获得四氧化三铁磁性纳米粒子，将其分散于去离子水溶液中保存。取10ml该溶液(约30mg四氧化三铁磁性纳米颗粒)于烧杯中，加入0.50g的酒石酸氢钠粉末，搅拌使其逐渐溶解，常温超声4h以上，随后进行磁吸附分离，去掉上清，加入去离子水，重复洗涤5次，以除去未包裹的酒石酸氢钠，最终得到酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒。

(2)上述磁性纳米颗粒分散于10ml去离子水中，逐滴加入0.10moll^-1的naoh溶液，使溶液的ph达到9.0-10.0之间，以保证磁性颗粒表面的羧酸根呈羧酸盐状态；再利用外部磁铁富集磁性物质，除去naoh溶液；最后用去离子水洗涤5次，保存于水溶液中。

(3)将上述经过naoh处理的磁性纳米颗粒溶液(10ml)加入15ml的10mgml^-1niso4，超声反应4h，反应结束后进行磁分离，沉淀用去离子水洗涤5次，以去除多余的niso4，最终得到螯合镍的酒石酸氢钠修饰的四氧化三铁纳米颗粒(以镍-sb磁性纳米颗粒表示)。

对制备获得的镍-sb磁性纳米颗粒进行透射电镜和xps表征分析，结果如图1、2所示。

图1可以看出本发明所制备的磁性纳米颗粒约为10-20nm，且颗粒表面有一层薄膜状的结构。从图2(a)c1sxps图谱可以看出，284.8ev、286.2ev、288.7ev三个峰位分别证明存在c-c、c-o以及o＝c–o–，说明酒石酸氢钠成功包裹到磁性颗粒表面。图2(b)中所示的ni2s峰说明镍离子成功螯合到磁性纳米材料表面。

实施例2镍-sb磁性纳米颗粒的应用

镍-sb磁性纳米颗粒从复杂的大肠杆菌裂解液中分离纯化组氨酸标签重组蛋白的方法，具体步骤如下：

(1)将表达六个组氨酸标签的重组蛋白的大肠杆菌经异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷诱导表达后，收集菌液，加入蛋白提取裂解液后进行超声破碎，高速离心后取上清即为大肠杆菌总蛋白溶液。

(2)取200μl的镍-sb磁性纳米颗粒(2mg/ml)于磁力架上进行磁分离，弃上清，加入300μl上述细菌总蛋白溶液，重悬纳米颗粒，于4℃旋转结合1h，磁分离，上清为磁性材料吸附后的上清溶液。

(3)步骤(2)获得的磁性颗粒进一步用50×咪唑溶液(50mmtris,150mmnacl,50mm咪唑,ph7.5)震荡洗涤10min，磁分离，弃上清，重复洗涤3次，以洗脱未吸附的蛋白。

(4)在步骤(3)得到的磁性材料中加入300μl的250×咪唑溶液(50mmtris,150mmnacl,250mm咪唑,ph7.5)，旋转洗脱10min，磁分离后的上清即为分离纯化后的组氨酸标签重组蛋白。

(5)对步骤(1)、(2)、(4)分别获得的细菌总裂解液、吸附后的上清溶液和洗脱的纯化组氨酸标签蛋白溶液经sds变性后，通过sds-page电泳和考马斯亮蓝染色鉴定蛋白条带。图3为镍-sb磁性纳米颗粒分离纯化六个组氨酸标签的人碳酸酐酶重组蛋白的电泳图；

图4为镍-sb磁性纳米颗粒分离纯化六个组氨酸标签的人pin1重组蛋白的电泳图。

图3中，第1泳道为大肠杆菌总蛋白条带，第2泳道为吸附后的上清，第3泳道为纯化的带六个组氨酸标签的碳酸酐酶重组蛋白条带，分子量约为30kd，在第3泳道中，25-35kda之间出现一条明显的蛋白条带，与目的蛋白分子量相符，在吸附后上清中，该位置条带很弱，且其它部位存在明显的杂蛋白，说明镍-sb磁性纳米颗粒可实现复杂细菌裂解液中特异、高效的结合组氨酸标签蛋白，且可被250×的咪唑竞争洗脱，得到纯化的组氨酸标签蛋白。图4结果显示，镍-sb磁性纳米颗粒成功分离纯化六个组氨酸标签的人pin1重组蛋白(约为15kd)，表明本发明制备的磁性材料同样适用于分子量更小的组氨酸标签重组蛋白的分离纯化。

实施例3镍-sb磁性纳米颗粒最大结合能力的测定

具体步骤如下：

取50μg镍-sb磁性纳米颗粒与不同浓度的已经纯化的组氨酸标签碳酸酐酶蛋白溶液在4℃旋转孵育1小时，磁分离后，通过bradford法测定上清溶液中未结合的碳酸酐酶蛋白浓度。

镍-sb磁性纳米颗粒的吸附量(qe,mgg^-1)通过公式(1)计算获得。

其中c0(mgml^-1)为碳酸酐酶的起始浓度，cs(mgml^-1)为吸附后上清溶液中的蛋白浓度，v(ml)为蛋白溶液的体积，m(g)为磁性材料的质量。

吸附等温线符合langmuir模型，根据公式(2)计算出饱和吸附量qm(mgg^-1)，即最大结合能力。

实施例4镍-sb磁性纳米颗粒分离纯化组氨酸标签蛋白的重复使用

具体步骤如下：

同实施例2的步骤分离纯化组氨酸标签的碳酸酐酶蛋白后，磁性材料用蛋白提取裂解液洗涤3次以后，吸取300μl大肠杆菌总蛋白溶液加入到磁性材料中混匀，同样进行组氨酸标签蛋白质的结合、分离和纯化，此操作过程重复5次，将每次收集的洗脱蛋白溶液进行sds-page检测。

结果如图5所示，从图5中2-7的蛋白条带可以看出，镍-sb磁性纳米颗粒对组氨酸标签的碳酸酐酶蛋白具有较好的吸附能力和特异性，重复使用6次以后，分离纯化蛋白能力依然良好，表明本发明制备的磁性材料具备较好的稳定性和循环使用性。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。