层析介质和层析装置的制作方法

1.本发明涉及层析介质和包含层析介质的层析装置，尤其涉及以具有规则内部结构和孔道排列的高分子微粒构成的层析介质以及层析装置。


背景技术：

2.凝胶过滤色谱（gel filtration chromategraphy，gfc），又称为分子排阻层析技术（molecular-exclusion chromategraphy，mec），是尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography，sec）的一个分支，其主要是利用多孔结构的凝胶的分子筛作用，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法，特点是各组分之间不存在化学性质的相互影响，分离条件温和、样品回收率高，是目前生命科学领域应用最为广泛的分离方法之一；gfc的基本原理是当不同质量分子大小的蛋白质等生物大分子以及其他复杂分子的混合物通过含有多孔凝胶的层析柱时，蛋白小分子可以通过较小以及较大的孔道进入固定相内部，蛋白大分子只能通过较大的孔道进入固定相内部，而更大的蛋白分子则无法进入固定相内部，而只能在固定相颗粒间隙停留，后与流动相一同流出；原则上，蛋白大分子先被洗脱，蛋白小分子滞后洗脱，达到有效分离混合物的目的。
3.常规的凝胶渗透色谱方法通常采取柱式填装方法将固定相填装至柱管内，再将分离产物引入至柱管内时，同时将含有特定成分的流动相引入色谱柱，流动相一般是具有一定惰性的且对样品具有一定溶解能力的溶剂，不控制分离度，因此色谱柱的分离情况与样品、流动相之间的相互作用无关，相对地，固定相具有决定分离效果的特性；常用的固定相种类为亲水性有机凝胶，最重要的一类是多糖凝胶球，其在分离、纯化小分子、生物活性物质等的离子交换色谱、亲和色谱及疏水作用色谱柱中有着广泛的应用。
4.鉴于其在生物医药分离中的广泛用途与巨大成功，包括琼脂糖基质的生物大分子微球的相关专利文献浩如烟海。最早的相关文献包括hjerten, s. biochim. biophys. acta 1964, 79:393-398; and bengtsson et al., s. biochim. biophys. acta 1964. 79:399,最早的琼脂糖微球相关专利包括u.s. pat. no. 4,647,536，而用于色谱柱的多糖微球则更早地就出现在学术与专利文献中。研究证明，在亲和色谱、离子交换色谱等技术中，介质的孔道结构与蛋白可及面积密切相关，决定了包括载量和分辨率等在内的蛋白分离效果。因此，多糖凝胶球作为色谱柱的介质，其内部孔径结构、大小及其尺寸分布、球的尺寸及其分布、形状及其机械性能等对分离效果、分离速度都有着巨大的影响。然而目前已知的、通过机械搅拌、均质乳化、以及膜乳化法等方法制备的多糖凝胶球都无法控制其内部孔径的结构，同时鉴于其通常的固有柔软特性，目前多糖凝胶微球都比较软，能够承受的压力有限，相应的色谱柱也局限于低速生物蛋白分离应用领域。另外，目前用途最为广泛的琼脂糖微球其原材料由海藻中经过多种步骤提取而得，是一种相比较不易于大规模工业化生产的高成本原材料。
5.另一方面，部分待分离的生物活性物质由于其耐受温度、剪切力和溶液环境变化的能力差，很容易因发生结构性变化而失去活性，所以针对活性物质的层析条件要求相对
苛刻，通常需要具备良好的机械性能和化学稳定性，较高效的分离效率，否则会导致被分离物的变性变质。
6.因此，需要提供一种应用于凝胶渗透色谱的层析介质，其具有粒径均匀可控，且具有规则的内部结构及孔道分布而且具备一定强度，以用于提高色谱分离中色谱柱的分离效率，并且节省时间。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种应用于凝胶过滤色谱的层析装置，其通过采用一种内部孔道至少为局部有序的排列结构的高分子材料为层析介质，以满足所述需要。
8.以下通过示例并结合系统、工具和方法，对本发明的实施方案及其目的进行描述和说明。这些示例仅是示例性的和说明性的、而非限制性的。在不同实施方案中，上述一个或更多个市场需求以及通过本发明得到满足，而另一些实施方案则针对其他改进。
9.本发明的主要目的是提供一种层析介质，该层析介质是应用于凝胶过滤色谱的层析介质，上述层析介质至少部分由包括刚性纳米粒子在内的至少部分可交联的物质交联而形成的高分子材料构成，其中至少一种所述刚性纳米粒子在溶液中具有非球对称的形状，所述刚性纳米粒子在所述层析介质中至少局部形成有序的排列结构。
10.本发明的其中一个目的是提供一种层析介质，填充于其中的高分子材料至少部分为高分子微粒，其中，高分子微粒内部具有排列呈局部有序或整体有序的刚性纳米粒子。
11.本发明的另外一个目的是提供一种层析介质，层析介质由包括刚性纳米粒子在内的至少部分可交联的物质整体交联而形成，其中，刚性纳米粒子在所述层析介质中至少局部形成有序的排列结构。
12.本发明的另外一个目的是提供一种应用上述层析介质的层析装置。
13.根据本发明的目的，本发明提供了一种层析介质，所述层析介质至少部分由包括刚性纳米粒子在内的至少部分可交联的物质交联而形成的高分子材料构成，其中至少一种所述刚性纳米粒子在溶液中具有非球对称的形状，所述刚性纳米粒子在所述层析介质中至少局部形成有序的排列结构。
14.作为本技术的进一步改进，所述层析介质由所述高分子材料堆积而成，所述高分子材料至少部分为高分子微粒，所述高分子微粒由包括刚性纳米粒子在内的至少部分可交联的物质交联而形成，其中至少一种所述刚性纳米粒子在溶液中具有非球对称的形状，所述刚性纳米粒子在所述高分子微粒中至少局部形成有序的排列结构。
15.作为本技术的进一步改进，所述高分子微粒内部具有刚性纳米粒子有序排列的一个或多个区域，所述多个区域间的分子排列无关联、相关联或者部分相关联。
16.作为本技术的进一步改进，所述层析介质由包括刚性纳米粒子在内的至少部分可交联的物质整体交联而形成，其中至少一种所述刚性纳米粒子在溶液中具有非球对称的形状，所述刚性纳米粒子在所述层析介质中至少局部形成有序的排列结构。
17.作为本技术的进一步改进，所述非球对称的刚性纳米粒子其形状为以分子长轴方向为特征方向的棒状、带状、片状、针状、或线状。
18.作为本技术的进一步改进，所述非球对称的刚性纳米粒子其形状为特征方向垂直于平面方向的盘状。
19.作为本技术的进一步改进，所述层析介质内部整体有序，所述特征方向沿微粒半径方向分布、沿微粒双极轴方向分布或在微粒内部呈多个同心圆分布中的任意一种。
20.作为本技术的进一步改进，在有序的局部区域，所述特征方向呈平行、扇形或螺旋排列。
21.作为本技术的进一步改进，所述刚性纳米粒子选自多肽、蛋白质、核酸、多糖和脂类中的至少一种。
22.作为本技术的进一步改进，具有非球对称的形状的刚性纳米粒子为纤维素纳米晶或纤维素纳米纤维。
23.作为本技术的进一步改进，所述层析介质进一步包括在溶液中不形成明显非球对称的形状的多糖化合物，所述多糖化合物与所述刚性纳米粒子共聚形成所述层析介质。
24.作为本技术的进一步改进，所述刚性纳米粒子与所述多糖化合物的质量比为1:10-50:1。
25.作为本技术的进一步改进，所述多糖化合物选自琼脂、琼脂糖、葡聚糖、淀粉、壳聚糖和海藻糖中的至少一种。
26.作为本技术的进一步改进，所述层析介质的分离范围为50-300000 kda。
27.另一方面，本技术还公开了一种层析装置，包括承载体；填充于承载体内部或涂覆于承载体表面的层析介质；所述层析介质包括上述任意一种或多种层析介质。
28.作为本技术的进一步改进，所述承载体为柱形壁材、平板基材或弯曲的中空管道中的任意一种。
29.作为本技术的进一步改进，所述的柱形壁材的轴向截面为圆形、椭圆形或多边形中的任意一种。
30.作为本技术的进一步改进，所述承载体材质选自塑料、玻璃、陶瓷、金属中的任意一种或多种。
31.有益效果：本发明公开的应用于凝胶过滤色谱的层析介质以及层析装置，采用至少局部具有有序的内部结构和孔道分布的高分子微粒堆叠形成固定相，或采用刚性纳米粒子在层析介质中至少局部形成有序的排列结构的整体结构为固定相，可以有效提高分离纯化速度，缩短出峰时间，峰形具有更佳的对称值，有效降低半峰宽，提高柱效。
附图说明
32.图1示出了现有技术中多孔层析介质的结构示意图；图2示出了本技术中多孔层析介质的结构示意图；图3包括四张图片，其中(a)为本技术公开的一种高分子微粒的剖视图；(b)为图3中的(a)中d部分的细节放大图；(c)为图3中的(a)中e部分的细节放大图；(d)为部分实施例中高分子微粒的扫描电镜图片；图4包括四张图片，其中(a)为高分子微粒的射线型构象；(b)为高分子微粒的双极型构象；(c)为高分子微粒的环型构象；(d)为射线型构象的高分子微粒的正交偏光显微镜
图；图5示出了本技术中多种层析介质的结构示意图；图6包括两张图片，其中(a)为层析装置的结构示意图；(b)为层析装置的分离原理；图7示出了其中两种层析装置的结构示意图；图8示出了图6中的(a)中层析装置沿a-a’方向的轴向截面形状；图9为根据本发明预备例1制备的高分子微粒的正交偏光显微镜图；图10为根据本发明预备例2制备的高分子微粒的正交偏光显微镜图；图11为根据本发明预备例3制备的高分子微粒的正交偏光显微镜图；图12为根据本发明预备例4制备的高分子微粒的正交偏光显微镜图；图13包括三张图片，示出了实施例1-4和对比例1制备的层析装置分离各标准品的凝胶过滤色谱(gfc)的结果；其中，(a)中标准品为丙酮；(b)中标准品为细胞色素c；(c)中标准品为牛血清白蛋白；图14示出了实施例5和对比例2制备的层析装置分离各标准品的凝胶过滤色谱(gfc)的结果。
具体实施方式
33.为使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术具体实施例及附图对本技术技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例，不用来限制本发明的范围。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
34.无论是所谓的整体柱还是微球填充柱，现有用于色谱分析的层析介质一个最为突出的特点是孔道是无序的。例如图1中的(a)显示的、最常见的琼脂糖微球制备的层析介质，其结构是层析装置内琼脂糖型层析介质100由琼脂糖微球101填充而成。琼脂糖型层析介质的局部a部分的细节放大图（如图1中的(b)所示）展示了琼脂糖微球的堆积结构；图1中的(c)进一步显示出多孔琼脂糖微球的孔道是由琼脂糖无序排列、交联而成的结构。事实上，琼脂糖微球101的具体的制备方法是通过分散琼脂糖于水中，并通过适当的乳化技术，形成悬浮在油相中的含有多糖的微小水性液滴，琼脂糖微球内部b部分的细节放大图（如图1中的(c)所示），当乳化液温度冷却后，多糖化合物102的单链形成双螺旋结构，进而在分子束间形成孔道103，最后在交联剂104的作用下形成多糖微球。因多糖分子在水中无序排列，如此形成的凝胶微球其内部孔道排列因而也无序排列，同时鉴于多糖分子的固有柔软特性，其交联而成的微球通常也相对比较柔软。
35.根据本发明的精神，利用不具有球对称性的刚性纳米粒子，能够制备出具有分子排列有序、孔道相应可控、机械性能优良的多孔层析介质。如图2中的(a)和(b)所示，图2中的(a)所示的内部结构至少局部有序的层析介质200至少局部其构成的分子有序排列，其相应形成的孔道也具有某种有序排列，如图2中的(b)所示。
36.自然界中很多生物大分子单独或者分散于水中时呈现非球对称的、刚性的形态，根据溶致液晶理论，当这类刚性纳米粒子（同后文所称生物大分子）分散于溶剂中时，根据
刚性纳米粒子的浓度以及刚性纳米粒子的特征，刚性纳米粒子在溶剂中可能无序排列，或者随着刚性纳米粒子浓度的增加而形成包括向列相（如烟草镶嵌病毒类纳米材料）、近晶相、胆甾相、柱状相液晶等某种溶致液晶的有序的分子排列。具有有序排列的液晶材料通常展示出光的双折射特性，因此形成有序排列的含有非球对称性的生物大分子的微滴或者溶剂在偏光显微镜下清晰可见，并呈现常见的液晶构象。
37.根据本发明的精神，图2中的(b)为图2中的(a)中c部分的细节放大图，展示了部分的内部结构至少局部有序的层析介质200，其含有刚性纳米粒子201。刚性纳米粒子201达到液晶临界浓度或者以上后，纳米粒子形成有序排列，进而在纳米粒子之间形成有序排列的孔道，即有序孔道202，另外，部分纳米粒子未能形成有序排列，进而形成的孔道也为无序孔道203；进一步经过交联过程，包括加入交联剂或其它柔性分子，形成交联后达到或超过液晶临界浓度区域的刚性纳米粒子201，部分纳米粒子仍然有序排列，且有序孔道202相应排列的层析介质。
38.类似于多孔琼脂糖微球堆积的层析介质，根据本发明的精神，形成孔道有序排列的层析介质的一种方法是利用孔道有序排列的高分子微粒堆积而成，具体描述如图3所示。
39.根据本发明的精神，当刚性纳米粒子为生物大分子的时候，能够制备出具有至少分子局部有序、孔道有序排列的多孔生物大分子聚合物微球。这些孔道有序的微球堆积后，可以获得所述层析介质的整体结构中至少局部形成有序的排列结构。
40.具体地，具有合适长径比、尺寸分布的纤维素纳米晶（cnc）是一种在其溶剂水中具有一定刚性、能够形成溶致液晶相的生物大分子。根据本发明的精神，当生物大分子为纤维素纳米晶（cnc）并当浓度达到临界值时，cnc分子会自组装形成有序排列，从而显现出具有有序排列的液晶相；同时，纤维素纳米晶cnc生物大分子具有手性，所形成的分子有序排列结构会形成胆甾相等具有螺旋结构的液晶分子排列。
41.图3是根据本技术公开的一种具有多孔结构的高分子微粒。具体地，图3中的(a)示出了沿高分子微粒的直径方向的部分内部剖视图，刚性纳米粒子在交联后仍然可能保持至少部分有序排列，并且受分子排列的影响，其形成的孔道也可能局部规则排列，如图3中的(b)所示。图3中的(a)所示的刚性纳米粒子溶液在也可能是局部有序状态时被乳化形成乳滴，乳滴内的刚性纳米粒子201也类似地趋向于如图3中的(a)所示的部分有序排列。当乳液降温后刚性纳米粒子201保持排列并进一步交联形成高分子微粒时，其内部结构至少部分地保留之前的有序构象，同时如图3中的(b)所示，出现在刚性纳米粒子的排列之间的有序孔道202也继承了同样的有序构象，从而形成高分子微粒的孔道至少局部形成有序的排列结构。所谓有序指的是，至少在局部区域内，所述孔道的局部段落与邻近孔道的至少局部段落，两者方向与位置的排列具有一定的规律性，具体地，至少在局部区域内，所述孔道的至少局部段落与邻近孔道的至少局部段落呈平行、扇形或螺旋排列；如图3中的(d)所示，作为优选的实施例，所述孔道直径为1-1000纳米。
42.根据本发明的精神，通过控制刚性纳米粒子的浓度，刚性纳米粒子在乳滴中所形成的有序的排列结构可以包括一个或多个区域，同时，多个区域的分子排列可以无关联、相关联或者部分相关联；而且，上述有序的排列结构可以是整体有序，也可以是部分有序；当为整体有序时，在有序的局部区域，刚性纳米粒子的特征方向为沿微粒半径方向分布、沿微粒双极轴方向分布或在微粒内部呈多个同心圆分布，当为部分有序时，在有序的局部区域，
刚性纳米粒子的特征方向呈平行、扇形或螺旋排列。
43.在整体有序的范围内，由这些有序的排列结构，在结构上可形成一些特殊的构象，如图4中的(a)所示的射线型（特征方向沿着半径方向有序排列），内部形成规则指向圆心排列的第一孔道401，还可以形成如图4中的(b)所示的双极型（特征方向沿着双极轴方向有序排列），内部形成规则沿双极轴方向排列的第二孔道402，还可以形成如图4中的(c)所示的环型（特征方向形成多个同心圆排列），内部形成呈同心圆规则排列的第三孔道403，但本技术不限于此，也可是其他的有序构象。同时这些特殊的构象由于刚性纳米粒子通常具有的光学双折射特性而在偏光显微镜下形成特殊的光学现象。例如，如图4中的(a)所示，刚性纳米粒子201的特征方向在乳滴中趋向于沿着半径方向有序排列，形成的高分子微粒的内部结构和孔道也趋向于沿着半径方向有序排列，从而具有射线型的构象，在正交的偏光显微镜下可展示马耳他黑十字的光学各向异性（如图4中的(d)所示）。
44.在部分有序的范围内，如图3中的(a)所示，高分子微粒内部包括多个如图3中的(b)所示的d部分和如图3中的(c)所示的e部分，d部分为刚性纳米粒子特征方向有序的局部区域，e部分为特征方向无序排列的区域，高分子微粒内部同时形成有序孔道202和无序孔道203，此时高分子微粒虽然不存在特定的构象，但由于其特征方向依然在小范围内呈规律排列，所以仍能在正交的偏光显微镜下显色。
45.通过本发明展示的制作方法，可以获得不同尺寸的至少部分有序排列的刚性纳米粒子液滴并经过交联后形成这种具有至少局部分子、孔道有序排列的高分子微粒。作为优选的实施例，高分子微粒在通常是水性溶剂的溶剂中的平均粒径为1-500微米，更优选地，粒径范围在5-150微米，高分子微粒的粒径太小，容易造成层析柱的反压较高，但粒径过大，则会使得柱效降低。
46.根据本发明的精神，高分子微粒301由包括刚性纳米粒子201（即生物大分子）在内的至少部分可交联的物质交联而形成，其中至少一种所述刚性纳米粒子在溶液中具有非球对称的形状，刚性纳米粒子其形状为以分子长轴方向为特征方向的棒状，也可以为以分子长轴方向为特征方向的弓状（香蕉状）、抑或是特征方向垂直于平面方向的盘状，还可以为片状、针状、线状，但本技术不限于此，也可采用其他符合要求的非球对称的形状。
47.具有或不具有非球对称的形状的刚性纳米粒子选自多肽（如胰岛素、生长激素）、蛋白质（如叶绿蛋白、胶原等）、核酸（如dna）、多糖（如纤维素、壳聚糖）和脂类（如甘油单酸酯、磷脂、糖脂、类固醇等）中的至少一种，这些生物大分子普遍存在于生物体内，在溶液中多呈现棒状或扁平状。作为优选的实施例，具有非球对称的形状的生物大分子具有或不具有手性特征，进一步地，具有手性特征的生物大分子包括左旋与右旋手性生物大分子，所形成的液晶相形成胆甾相螺旋结构的液晶分子排列；本技术的一个具体实施例是生物大分子纤维素纳米晶（cnc），结构式如下：
生物大分子形成的棒状结构具有较大的长径比，更易形成液晶态。作为进一步优选地实施例，纤维素纳米晶的长度为20-1000纳米，宽度为2-100纳米，长径比为1:5-1:200。
48.如图3中的(b)所示，高分子微粒还可进一步包括不具有非球对称的形状的多糖化合物102，这些多糖化合物与生物大分子共聚形成高分子微粒。这些多糖化合物选自琼脂、琼脂糖、葡聚糖、淀粉、壳聚糖和海藻糖中的至少一种，本技术的具体实施例中，多糖化合物为琼脂糖，结构式如下：多糖化合物在乳化前是可以流动的凝胶状分散液，乳化成乳滴后，经过冷却、固化和老化等过程，如图3中的(b)所示，多糖化合物102由单链形成双螺旋，继而形成束捆状态，最终形成稳定的固态微粒；虽然这些多糖化合物在溶液中不会自行地有序排列，但由于这些多糖化合物与生物大分子间的包括氢键在内的多种相互作用，其会随着生物大分子排列，最终也形成有序的排列，同时，在一些情况下，生物大分子在特定浓度下会部分有序排列形成液晶态，多糖化合物会以大分子排列方式为模板进行排列；这些多糖化合物与生物大分子在交联剂辅助下进一步共聚，形成稳定的微粒结构，在不破坏所形成的高分子微粒的有序结构的前提下，可以进一步提高形成的高分子微粒的耐压性。同时，在高分子微粒的制备过程中，多糖化合物（如琼脂糖）可以通过冷却将乳化后的乳滴固化而为后续的交联聚合提供结构上的支撑，从而简化制备工艺。
49.根据本发明精神，获得层析介质至少局部孔道有序结构的优选方法是，如图5中的(a)所示，内部结构至少局部有序的层析介质200是全部由含有非球对称刚性纳米粒子，并且形成至少局部分子有序排列的高分子微粒301堆积而成的。根据本发明的精神，含有至少局部孔道有序的内部结构至少局部有序的层析介质200还可以通过堆积孔道有序的高分子微粒301与内部孔道无序的微粒501形成，如图5中的(b)所示；也可以通过堆积孔道有序的高分子微粒301以及无孔道的微球502，如图5中的(c)所示。常见的孔道无序的微球包括多糖微球，比如琼脂糖微球，而常见的无孔道的微球包括无机二氧化硅微球，羟基磷灰石等。
50.根据本发明的精神，针对含有高分子微粒的层析介质的制备，包括将刚性纳米粒子单独或与适量的无定型的单体或者寡聚物分散形成溶致液晶溶液，然后通过乳化的方法形成乳滴后再经过固化，交联等若干步骤形成聚合物多孔微球，其中，刚性纳米粒子在高分
子微粒中可能被周围聚合物物理包裹镶嵌在聚合物微球中，也可能直接参与交联反应，通过化学键合的方式成为聚合物的一部分。
51.当层析介质是由包括刚性纳米粒子在内的至少部分可交联的物质整体交联而形成，其中至少一种所述刚性纳米粒子在溶液中具有非球对称的形状，所述刚性纳米粒子在所述层析介质中至少局部形成有序的排列结构；具体地，如图5中的(d)所示，内部结构至少局部有序的层析介质200是由有序排列的整体聚合物形成的整体结构，但本技术不限于此，所述层析介质还可以包括其他可以预见的范围。
52.根据本发明的精神，针对由刚性纳米粒子交联形成的整体结构作为层析介质，区别于聚合物多孔微球的制备方法，在形成局部或者整体有序排列的溶致液晶溶液后，直接加入交联剂进行原位聚合，具体操作是将刚性纳米粒子在内的分散液加入不锈钢预装柱中，控温的同时滴加交联剂，调整ph，反应干燥后，即可得到至少包括刚性纳米粒子以及刚性纳米粒子在整体结构中至少形成局部有序的排列结构。
53.层析介质的装填方法通常包括高压匀浆法装填、湿法装填、干法装填以及高密度高粘度法装填；高压匀浆法装填是将填料悬浮在适宜的匀浆液中制成匀浆，在其尚未沉降之前，很快以高压泵将其以很高的流速压进柱中，便可制备出填充均匀的柱子。这是常见的分析和制备色谱柱的装填方法，也是本技术所采用的装填方法；湿法装填是针对3-10微米的小粒径填料填装的高效分析柱，为得到均匀而紧密的柱床，通常使用湿法装填；干法装填是针对粒径较大的粉体状填料（多用于制备色谱），如粒径≥50微米的填料，通常可以采用干法装填；高密度高粘度法装填的应用环境是当层析填料密度过大，对于柱床均匀性要求高时，方法是通常采用配置较高密度或较高粘度的匀浆液使填料悬浮在匀浆液中，随着外加压力填料逐层沉降堆积。
54.本技术还公开了一种层析装置，图6是根据本技术公开的一种柱形层析装置的结构示意图，如图6中的(a)所示，所述层析装置包括承载体600以及填充于承载体内部或涂覆于承载体表面的内部结构至少局部有序的层析介质200，所述层析装置还包括位于承载体两端部的待过滤样品入口601和待过滤样品出口602。
55.本技术的层析装置的分离原理如图6中的(b)的所示，多孔的高分子微粒301在分离不同大小（分子量大小）的分子（例如：蛋白质）时，蛋白小分子603可以通过较小以及较大的孔道进入固定相内部，蛋白大分子604只能通过较大的孔道进入固定相内部，而超大蛋白分子605则无法进入固定相内部，而只能在固定相颗粒间隙停留，后与流动相一同流出；原则上，超大蛋白分子先被洗脱，蛋白大分子后被洗脱，蛋白小分子最后被洗脱，达到有效分离混合物的目的。
56.另外，由于本技术中的高分子微粒具备至少局部有序的特征方向排列以及孔道排列，相同大小的分子扩散进入和离开高分子微粒的路径是有规律以及确定的，与内部排列不规则的固定相相比，待分离样品分子在本技术层析装置中出峰时间更短，即其保留时间被进一步缩短。
57.作为优选的技术方案，如图7所示，所述承载体选自柱形壁材701（如图7中的(a)所示）、平板基材702（如图7中的(b)所示）或弯曲的中空管道中的任意一种，具体地，如图6所示，承载体600的沿a-a’方向的剖面形状可以为圆形（如图8中的(a)所示）、椭圆形（如图8中
的(b)所示）以及长方形（如图8中的(c)所示）或六边形(如图8中的(d)所示)等多边形中的任意一种；当承载体为平板基材时，层析介质以一定厚度涂覆于平板基材表面，当承载体为柱形壁材或弯曲的中空管道时，层析介质填充于承载体内部。作为优选的技术方案，所述承载体材质选自塑料、玻璃、陶瓷、金属或它们的复合物中的任意一种。
58.根据本发明的精神，本技术还提供了一种制备上述层析介质的方法，当层析介质为至少部分的高分子微粒堆积而成时，制备方法包括如下步骤：第一步，制备所述的高分子微粒，本发明的实施例可包括制备高分子微粒的方法，描述如下：首先，包括将生物大分子和多糖化合物分散形成分散液，具体地，是将生物大分子和多糖化合物分散在水中，形成分散相溶液；其次，还包括将分散液乳化形成乳滴；乳化的方法有很多种，包括膜乳化法。膜乳化法是指在乳化过程中，分散相通过微孔膜的孔直接进入连续相，乳化液滴在孔的末端形成并以逐滴挤出；最后，还包括交联上述乳滴，具体过程是在形成的乳滴中加入交联剂，交联乳滴中的生物大分子，形成高分子微粒；第二步：称取一定量的制备好的高分子微粒，优选地，可选择通过抽滤方式洗涤2-3次，然后将洗涤后的高分子微粒分散在匀浆液中充分溶胀，形成悬浮液。匀浆液为超纯水或不同浓度的磷酸盐缓冲液，本技术不做特别限定，在以下实施方案中，所采用的匀浆液均采用超纯水；第三步：将第二步制备得到的悬浮液填充至所述柱体内，采用匀浆法装柱，流动相选择超纯水；具体地，将悬浮液倒入匀浆罐中等待固定相自由沉降，待沉降填满后，每10分钟增加流动相流速0.5毫升/分钟，实时观测流速与压力对应关系，当压力达到0.2-0.25兆帕时，停止增加流速，观察压力是否变化，如果没有明显增加，则可以视为装填紧实且填料并无破损，最终形成包含有高分子微粒的层析装置。
59.当层析介质是由包括刚性纳米粒子在内的至少部分可交联的物质整体交联而形成时，区别于高分子微粒的制备方法，在将生物大分子和多糖化合物分散形成分散液后，直接加入交联剂进行原位聚合，具体操作为：将纤维素纳米晶和琼脂糖的分散液加入不锈钢预装柱中，并通过加热套控温至80℃，防止分散液冷凝；滴加交联剂（1,4丁二醇二缩水甘油醚），之后加入0.5m氢氧化钠溶液，滴加完毕后置于38℃下反应12小时；最后将该整体柱进行冷冻干燥或临界点干燥后得到多孔整体柱床；加入大量乙醇和水洗涤未反应的物质，并将其再度冷冻干燥或临界点干燥后可得多孔整体凝胶层析装置。
60.下面将结合具体实施例，对本发明的层析介质的结构、制备以及层析装置的分离效果以及其制备方法进行详细说明。在本发明实施方案中，在本发明中如无特殊说明，所述的比例均为质量比。
61.预备例1制备含有5%纤维素纳米晶和1%琼脂糖的高分子微粒：将0.5克纤维素纳米晶和0.1克琼脂糖分散在9.4克水，在90℃搅拌，形成悬浮液。将上述悬浮液加入100克含有span 80（质量百分比浓度：10%）的液态石蜡中，在80℃搅拌乳化2分钟，冷却降温，形成含有固化的乳滴的分散液。洗涤，去除乳化剂和液体石蜡，将所得凝胶称重后，加入溶解有500微升交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚的10毫升水溶液，搅拌反应12小时。将500微升含有40wt%氢氧化钠和5wt%硼氢化钠的水溶液加入上述反应液中，搅拌反应8小时。将500微升环氧氯丙烷与500微升含有40wt%氢氧化钠和5wt%硼氢化钠的水溶液混合，加入反应液中，继续搅拌反
应12小时。反应结束后洗涤干净。如图9所示，在正交的偏光显微镜下，高分子微粒显示出射线型光学各向异性（手性马耳他黑十字），表明其具有射线型的内部结构和孔道分布。
62.预备例2区别于实施例1的方法，制备含有4%纤维素纳米晶和2%琼脂糖的高分子微粒，其余步骤和实验条件与实施例1相同；如图10所示，在正交的偏光显微镜下，高分子微粒显示出射线型光学各向异性（马耳他黑十字），表明其具有射线型的内部结构和孔道分布。
63.预备例3区别于实施例1的方法，制备含有2%纤维素纳米晶和4%琼脂糖的高分子微粒，其余步骤和实验条件与实施例1相同。如图11所示，在正交的偏光显微镜下，高分子微粒无明显射线型光学各向异性（马耳他黑十字），表明其射线型的内部孔道结构趋势减弱。
64.预备例4区别于实施例1的方法，制备含有1%纤维素纳米晶和5%琼脂糖的高分子微粒，其余步骤和实验条件与实施例1相同；如图12所示，在正交的偏光显微镜下，高分子微粒无明显射线型光学各向异性（马耳他黑十字），表明其射线型的内部孔道结构趋势减弱。
65.实施例1-4将预备例1-4所制备的高分子微粒筛分后保留粒径为60微米至90微米的高分子微粒，通过抽滤方式洗涤3次后，将洗涤后的高分子微粒分散在超纯水中充分溶胀，将形成的悬浮液采用上述匀浆法灌入规格为5*100mm的中空柱体内，分别形成相应的层析装置。
66.实施例5将预备例2制备的高分子微粒筛分后保留粒径为60微米至90微米的高分子微粒，通过抽滤方式洗涤3次后，将洗涤后的高分子微粒分散在超纯水中充分溶胀，将形成的悬浮液采用上述匀浆法灌入规格为16*400mm的中空柱体内，形成层析装置。
67.对比例1区别于预备例1的方法，制备含有固含量为6%的琼脂糖球，其余步骤和实验条件与预备例1相同；将固含量为6%的琼脂糖球筛分后保留粒径为60微米至90微米的高分子微粒作为固定相，其余步骤同实施例1-4。
68.对比例2区别于预备例1的方法，制备含有固含量为6%的琼脂糖球，其余步骤和实验条件与预备例1相同；将固含量为6%的琼脂糖球筛分后保留粒径为60微米至90微米的高分子微粒作为固定相，其余步骤同实施例5。
69.为验证本技术提供的层析装置具有较好的分离效果，对各实施例和对比例的层析装置进行多种标准品上样分离，在色谱柱检测中，所使用的蛋白纯化仪为akta pure；分离丙酮采用的流动相为超纯水，分离牛血清白蛋白以及的细胞色素c采用的流动相均为pbs溶液和氯化钠溶液的混合缓冲液。
70.实验例将实施例1-4和对比例1得到的层析装置分别连接至蛋白纯化仪，然后将流速控制在0.1毫升/分钟上样，样品为25微升0.5%丙酮（acetone）溶液；采用0.2毫摩尔/升的pbs溶
液和0.15摩尔/升的氯化钠混合缓冲溶液置换层析装置内的超纯水，然后将流速控制在0.1毫升/分钟上样，样品分别为25微升0.8毫克/毫升的牛血清白蛋白（bsa）溶液和25微升0.5毫克/毫升的细胞色素c（cytochromec）溶液，测试分离效果，结果示于表1和图13；将实施例5和对比例2的层析装置分别连接至蛋白纯化仪上，然后将流速控制在1毫升/分钟上样，样品为300微升1%丙酮溶液和300微升 1毫克/毫升蓝葡聚糖2000（blue dextran 2000）溶液，测试分离效果；采用0.2毫摩尔/升的pbs溶液和0.15摩尔/升的氯化钠混合缓冲溶液置换层析装置内的超纯水，然后将流速控制在1毫升/分钟上样，样品分别为300微升0.8毫克/毫升的牛血清白蛋白溶液、300微升0.5毫克/毫升的细胞色素c（cytochromec）溶液以及300微升1毫克/毫升igg溶液，测试分离效果，结果示于表2和图14。
71.由于丙酮分子可以经过层析装置的层析介质内的所有空间（包括微粒间隙和微粒内部孔道），因此一般可以通过丙酮的保留体积值计算出理论塔板数和对称性来评价层析装置填料是否符合应用标准。常规评判标准为：理论塔板数≥3000，不对称性介于0.8-1.5之间。由此根据表1数据及图13可知，除实施例4数据外，其余实施例样品均符合装填标准。通过分析样品峰的对称性可知，实施例3的样品峰不对称性均接近或超过1.5，拖尾现象较为明显，可以证明此类填料的孔道尺寸最小，不适合用于较大分子量样品的分离。综合对比，预备例1和预备例2得到的高分子微粒可以与相同固含量的传统层析填料进行对比代替。
72.我们采用装大容量柱子的方法来测定孔道体积；其中，蓝葡聚糖2000（2000 kda）为最大分子量标准品，此标准品过柱子时不进入高分子微粒的孔道，只从微粒与微粒之间的间隙通过，该标准品的保留体积值即为微粒间隙的体积值；丙酮（58 kda）为最小分子量标准品，此标准品可以进入层析装置固定相内的所有空间，包括微粒与微粒之间的间隙以及微粒内部孔道，该标准品的保留体积值即为微粒间隙与微粒孔道的体积和，因此，丙酮与
蓝葡聚糖2000的保留体积之差即为微粒孔道体积。
73.由表2数据可计算得出，实施例5中所采用的高分子微粒的孔道体积为17.301ml；对比例2所采用的无序孔琼脂糖球的孔道体积为18.237ml，因此，琼脂糖球的无序孔道体积较高分子微粒的有序孔道体积多0.936ml。
74.更进一步地，由表2数据可知，蛋白igg在实施例5中的有序孔道固定相中的保留体积值比对比例2中的无序孔道琼脂糖球快1.5ml，相应地，实施例5的牛血清蛋白和细胞色素c的保留时间分别比对比例2快2.24 ml和2.58ml，同时结合图14可知，样品在更有序的孔道的填料中流出速度更快，蛋白标准品的半峰宽值更小，可以证明在其峰形更尖，柱效更高。
75.虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
76.上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。