利用微流体截留涡流从异质溶液中分离细胞的装置的制造方法
【专利说明】利用微流体截留涡流从异质溶液中分离细胞的装置
[0001]本申请是申请日为2011年9月12日的题为“利用微流体截留涡流从异质溶液中分离细胞的方法和装置”的中国专利申请号201180044092.8的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求于2010年9月14日提交的美国临时专利申请号61/382，840的优先权。根据35U.S.C.§119要求优先权。上述专利申请通过引用合并，如同完全在本文中给出的。
技术领域
[0004]本发明的领域通常涉及用于分离和分选细胞或颗粒的微流体装置。更具体地，本发明的领域涉及微流体装置和方法，其采用微流体截留润流从异质溶液(heterogeneoussolut1n)中分离细胞或颗粒。
【背景技术】
[0005]在生命科学实验室中标准台式离心机是最常见的仪器之一，其在细胞生物学研究和医疗诊断中广泛用于样品制备。典型的样品制备过程需要用于细胞标记和洗涤的多个离心步骤，对于诊断和研究而言其可以是耗时、费力、和昂贵的过程。事实上，当测定本身已广泛微型化和自动化的同时，已将这些测定所需要的样品制备确定为未来自动化的关键目标。
[0006]离心机进行以下三个关键的样品制备步骤，其使得它们如此广泛地使用:(i)通过尺寸/密度分离细胞，(ii)细胞浓缩，以及(iii)溶液置换。由于离心机可以进行这样的不同功能，所以在微型化平台中实现这些功能一直充满挑战。微型化微流体方式常成功地实施这些功能中的一种或两种。例如，通过利用物理屏障(obstacle)、外力、或流体力将颗粒引导到在不同出口处用于收集的微通道中的限定位置，已进行了利用尺寸和密度的细胞分离。虽然这些方法可以提供高分辨率的细胞分离，但典型的经收集的液体体积类似于注入的液体体积，即，没有实现显著的浓缩。这种较大的输出体积可以阻碍下游细胞检测平台，其可能需要扫描较大的视场以观测关注的细胞，或如果必须溶解经收集的细胞，导致关注的生物分子的稀释。因此，必须连同分离系统一起在线使用浓缩方法以减小用于快速检测和分析的液体体积。
[0007]存在各种技术，用于借助于微流体系统在局部区域中浓缩颗粒和细胞。其中，机械截留(mechanical trap)是最常用的方法,其将颗粒和细胞固定至物理结构并且能够多步灌注试剂以在芯片上(on-chip)经由溶液置换来进行细胞检测。然而，通常可以重要的是，根据需要释放颗粒和细胞以供进一步的下游分析。虽然在浓缩和释放方面是成功的，但是当在较高的体积通量下操作时，固定在这些截留和释放(trap-and-release)系统中的细胞可以挤出截留并损坏，从而限制浓缩系数低于浓缩稀有细胞或细胞稀释液所需要的浓缩系数。因此，尚未得到通用的微型化工具，其涵盖常规离心机的所有功能和适用性。
[0008]在微流体结构内涡流的形成已用于聚焦和过滤增强。例如，Park等(Jae-Sunget al., Continuous focusing of microparticles using inertial lift forceand vorticity via mult1-orifice mult1-orifice microfluidic channels, LabChip, 9，939-948(2009))披露了一种在实验中使用的微流体装置，其集中刚性微颗粒，利用一系列突然扩展和收缩的通道。在特定流速下，在扩展通道内形成涡流。如管收缩效应一样，在扩展通道内形成的涡流致使横向颗粒移动。通过沿着微通道的长度，具有一系列这些扩展通道，刚性微颗粒能够逐步移动(即，集中)到微通道的相反侧。然而，重要的是，扩展通道并不捕获颗粒。相反，Park等披露了一种结构，其持续集中通过装置的微颗粒。在Park等中，使小直径(7μπι直径)的聚苯乙烯微球通过多孔微通道并且没有观测到这些颗粒的截留。Park等进一步观测到，较大尺寸的颗粒倾向于远离其中形成涡流的扩展通道区。Park等还披露了，在样品中的颗粒应类似于刚性球，以获得惯性升力的最大值，这显然违背了其用于活细胞，基于这些活细胞的性质，它们通常是可变形的。结构上，Park等披露了相当小尺寸的扩展通道，相对于上游收缩通道，其向外扩展约80 μ m的距离。另外，扩展通道的长度也较小，公开为200 μ m。
[0009]美国专利申请号2008/0318324 (Chiu等)披露了用于癌细胞的高通量筛查的生物芯片。该装置使用流出过滤以从体液样品中分离肿瘤细胞。流出过滤是指过滤结构，其中通过过滤介质或在流动通道内的任何形态特征分散或重新分配流体。在Chiu等中，过滤介质是宽度小于细胞的宽度的侧壁孔。在一种实施方式中，Chiu等披露了一维通道，其具有扩展和收缩点以放慢或加快流动。Chiu等披露了在高流速下，可以分离流体以形成内部微涡流，其有助于过滤操作(通过改变流体动力学)。然而，微涡流并不捕获通过该装置的细胞。而是，通过防止较大尺寸的细胞从其中通过，将通道分成段(line sect1n)的孔保留较大尺寸细胞。尽管披露了产生用于集中或过滤辅助目的的涡流，但这些结构并没有用于选择性地捕获其中的细胞。
【发明内容】
[0010]在本发明的一种实施方式中，分离细胞的方法包括提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，该至少一个微流体通道连接至入口和出口，该至少一个微流体通道包括沿着其长度设置的至少一个扩展区，该至少一个扩展区包括该至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，设置该至少一个微流体通道以响应于流体流动在该至少一个扩展区内产生涡流。使包含细胞群的溶液流入入口。至少一些细胞被截留在该至少一个扩展区内产生的涡流中，该至少一些细胞具有> ΙΟμπι的直径。通过降低溶液通过该至少一个微流体通道的流速，使截留细胞从多个扩展区释放。
[0011]在本发明的另一种实施方式中，置换经分离的细胞周围的溶液的方法包括提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，该至少一个微流体通道连接至入口和出口，该至少一个微流体通道包括沿着其长度设置的至少一个扩展区，该至少一个扩展区包括该至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，设置该至少一个微流体通道以响应于流体流动在该至少一个扩展区内产生涡流。使包含细胞群的第一溶液流入入口。至少部分细胞被截留在该至少一个扩展区内产生的涡流中。然后使不同于第一溶液的一种或多种溶液流入入口，同时持续保持该涡流包含截留细胞。
[0012]在本发明的另一种实施方式中，通过尺寸截留颗粒或细胞的方法包括提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，该至少一个微流体通道连接至入口和出口，该至少一个微流体通道包括沿着其长度设置的至少一个扩展区，该至少一个扩展区包括该至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，设置该至少一个微流体通道以响应于流体流动在该至少一个扩展区内产生涡流。使包含多种细胞或颗粒的溶液流入入口。至少一些细胞或颗粒被截留在该至少一个扩展区内产生的涡流中，其中尺寸高于阈值的细胞或颗粒基本截留在涡流内，并且其中尺寸低于阈值的细胞或颗粒基本通过涡流。
[0013]在本发明的另一种实施方式中，微流体装置包括基片(基板，substrate)，该基片包括连接至至少一个入口和出口的至少一个微流体通道，该至少一个微流体通道包括沿着该至少一个微流体通道的长度设置的至少一个扩展区，该至少一个扩展区包括至少一个微流体通道的横截面尺寸突然增加至少80 μ m，设置该至少一个扩展区以响应于流体流动在至少一个扩展区内产生涡流。
[0014]在本发明的另一种实施方式中，微流体系统包括基片，该基片包括连接至至少一个入口和出口的至少一个微流体通道，该至少一个微流体通道包括沿着该至少一个微流体通道的长度设置的至少一个扩展区，该至少一个扩展区包括至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，设置该至少一个微流体通道以响应于流体流动在至少一个扩展区内产生涡流。该系统包括至少一个泵，设置以将流体泵送至包含颗粒或细胞的至少一个入口中。计算机可操作地连接至至少一个泵并且设置该计算机以调节流体通过至少一个微流体通道的流速。
【附图说明】
[0015]图1A示出了根据一种实施方式的用于分离细胞的微流体系统。
[0016]图1B示出了根据另一种实施方式的用于分离细胞的微系统。
[0017]图1C示出了具有单扩展区的微流体通道的示意图。
[0018]图1D至图1G示出