一种控释型酵母细胞微胶囊产品及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一种制备控释型酵母细胞微胶囊的方法，涉及到酵母细胞的培养、处理、微胶囊制备及封孔修饰的方法，更进一步涉及通过该方法所制备的微胶囊壁材和微胶囊产品。
【背景技术】
[0002]微胶囊技术将固体、液体或气体(芯物质)包裹在另一种材料(壁材)中，能够保护芯物质免受环境影响并控制芯物质释放，是食品、香料、医药、农药等工业领域重点开发的高新技术之一。包封率和突释率是评价微胶囊制剂的两个最重要的指标，也是限制其广泛应用的关键技术问题。壁材的选择决定着所制备微胶囊产品的优劣，解决制备成本过高和壁材及辅助料的安全性问题是微胶囊研宄中急需解决的问题。乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)以其优良的安全性、生物相容性和生物降解性在近年来的微胶囊研宄中备受关注，但影响此类微胶囊质量的因素较多，除受芯物质、壁材本身理化性质的影响外，制备方法对微胶囊的外观、粒径、包埋度、包封率和释放性能等方面也有重要影响。此外，其亲脂性强，对水溶性物质的亲和力不高。
[0003]酵母细胞的细胞壁和细胞膜构成的双层囊腔结构是包埋物质的良好材料，酵母细胞微胶囊具有独特的优点:(I)酵母细胞微胶囊颗粒大小均匀，芯物质包埋到酵母细胞中后，能够受到酵母细胞壁和细胞膜的双重保护；(2)微胶囊化过程简单，不涉及任何有毒的试剂；(3)只要遇到潮湿的黏膜，芯物质便能持续地释放出来而不需破壁。
[0004]突释是指微胶囊制剂在24小时内大量释放芯物质的现象。微粒表面的孔隙率和内部的致密度与突释效应直接相关。酵母细胞微胶囊具有原料易得、价廉、对人类和生态环境安全等特点，通过对酵母细胞进行透性改造后，其对小分子物质的包埋性能得到了显著提高。由于芯物质进入酵母细胞内主要是通过扩散进行的，孔径越大，芯物质越容易进入到酵母细胞内部，但同时也越容易从酵母细胞中逸出。为此，需要一种对酵母细胞微胶囊进行封孔修饰，控制芯物质释放的方法。
[0005]酵母细胞表面带有负电荷，可以与带正电荷的阳离子聚合物之间通过静电作用、氢键及疏水作用等形成多聚电解质，从而在酵母细胞微胶囊表面复合一层阳离子聚合物膜，进而调节酵母细胞的孔隙结构，控制酵母细胞微胶囊的释放性能，减少芯物质的突释现象。
【发明内容】
[0006]本发明的技术原理是利用酵母细胞的细胞壁和细胞膜对芯物质进行包埋后，再利用其表面带有的负电荷与带正电荷的阳离子聚合物之间通过静电作用、氢键及疏水作用等形成多聚电解质，实现酵母细胞微胶囊的封孔修饰，通过控制膜厚度达到控制酵母细胞微胶囊释放的目的。
[0007]因此，本发明第一个目的是提供一种制备酵母细胞微胶囊壁材的方法，既能用于脂溶性物质包埋又能用于水溶性芯物质的微胶囊化，包括:
[0008](I)采用酵母细胞为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中进行摇瓶培养；
[0009](2)将所得的酵母细胞离心，洗涤后，冷冻干燥或重新悬浮在具有促进酵母细胞自溶的化学试剂中，在40?60°C的温度下进行振荡处理24?48小时。离心、洗涤后，再在20?40°C的温度下以氢氧化钠溶液处理24?48小时，离心、洗涤后，冷冻干燥即得到所述的微胶囊壁材。其中所述的化学试剂任一选自吐温-80或TritonX-100、溴化十六烷基三甲基铵、十二烷基硫酸钠、盐酸、氢氧化钠、乙醇、乙二胺四乙酸钠(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、氯化钾及氯化钠。
[0010]应当指出:加入化学试剂的作用在于促进酵母细胞自溶，如果加入高浓度的化学试剂则反应时间更短，如果加入低浓度的化学试剂则反应时间更长。因此在合适的浓度范围内，加入不同浓度的化学试剂，本领域技术人员显然可以通过控制时间长短来达到预期效果。
[0011]在一个具体实施方案中，所述的吐温-80的加入重量为0.1?5% ;或
[0012]所述的TritonX-1OO的加入重量为0.1?5% ;或
[0013]所述的溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)的加入重量为0.1?5% ;或
[0014]所述的十二烷基硫酸钠的加入重量为0.1?5% ;
[0015]所述的盐酸的加入重量为0.5?10% ;或
[0016]所述的氢氧化钠的加入重量为0.5?10% ;或
[0017]所述的乙醇的加入重量为I?20% ;或
[0018]所述的EDTA的加入重量为I?10% ;或
[0019]所述的DTT的加入重量为0.05?0.5% ;
[0020]所述的氯化钠的加入重量为I?20% ;或
[0021]所述的氯化钾的加入重量为I?20%。
[0022]在另一个具体实施方案中，摇瓶培养的步骤如下:斜面种子活化4小时后接入种子培养基，培养24小时后再按10%的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行发酵培养，发酵时间24小时，发酵温度28-32°C，转速180r/min。
[0023]在一个具体实施方案中，所述的菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeHan.)，斜面培养基为PDA培养基，种子培养基和发酵培养基为高糖培养基，组成为:蔗糖、酵母浸出物、无机氮源采用中心组合设计优化，再补充必要的矿物质。
[0024]在另一个具体实施方案中，所述的种子培养基和发酵培养基均为YPD培养基，组成如下:蛋白胨20.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、添水至lOOOmL，pH4_5。
[0025]在另一个具体实施方案中，所述的种子培养基和发酵培养基均为产脂培养基，组成如下:蛋白胨3.0g、酵母提取物8.0g、鹿糖170.0g、添水至1000mL。
[0026]还在另一个具体实施方案中，种子培养基和发酵培养基都为豆芽汁蔗糖培养基，配制如下:取黄豆芽200.0g，洗净，放入水中煮沸30min，用纱布过滤，取豆芽汁加蔗糖30.0g,添水至 100mL,调节 pH = 7.2。
[0027]在另一个具体实施方案中，酵母细胞处理的步骤如下:培养的酵母细胞离心、洗涤后，冷冻干燥。
[0028]还在另一个具体实施方案中，酵母细胞处理的步骤如下:培养的酵母细胞离心、洗涤后，重新悬浮于0.05?20%的化学试剂中，在40?60°C下处理24?48小时。离心、洗涤后，再在20?40°C的温度下以0.1?10%的氢氧化钠处理24?48小时，离心、洗涤后，冷冻干燥。
[0029]本发明的第二个目的是提供利用所制备的微胶囊壁材制备微胶囊的方法，包括:
[0030]步骤(1)-(2)，与前述相同；
[0031](3)将冻干后的酵母细胞微胶囊壁材与待包埋的芯物质如抗氧化剂、杀虫剂或除草剂溶液在20?40°C的温度下高频度接触24?48小时进行微胶囊化处理；
[0032](4)如果需要，采用高效液相色谱法测定微胶囊中芯物质的含量。
[0033]其中，包埋度定义(下同):包埋度(％)=实际包埋量/微胶囊重量X 100%
[0034]高频度接触定义(下同):以可以实现溶液组分充分混和的转速进行振荡的频度。本领域公知的转速50rpm/min以上或加压2MPa以上，例如50?75rpm/min、75?200rpm/min、或200rpm/min以上的振荡频度。
[0035]在一个具体实施方案中，利用所述的壁材制备微胶囊的步骤如下:将Ig酵母细胞与I?20mL I %的芯物质溶液在20?40°C的温度下高频度接触进行包埋。24小时后取出，离心、洗涤除去表面未包埋的芯物质，冷冻干燥。
[0036]在另一个具体实施方案中，所述的芯物质为1%杀虫剂阿维菌素，所述的溶液为乙醇溶液。
[0037]在另一个具体实施方案中，所述的芯物质为1%的除草剂精喹禾灵，所述的溶液为乙醇溶液。
[0038]在另一个具体实施方案中，所述的芯物质为0.2%的除草剂二氯喹啉酸，所述的溶液为乙醇溶液。
[0039]在另一个具体实施方案中，所述的芯物质为I %的水溶性抗氧化剂绿原酸，所述的溶液为水溶液。
[0040]在另一个具体实施方案中，所述的芯物质为I %的脂溶性抗氧化剂白藜芦醇，所述的溶液为乙醇溶液。
[0041]本发明的第三个目的是提供对酵母细胞微胶囊进行封孔修饰制备控释型微胶囊的方法。包括:
[0042]步骤(1)_(3)，与前述相同；
[0043](4)将酵母微胶囊壁材与芯物质溶液高频度接触所得微胶囊与阳离子聚合物溶液在20?40°C的温度下高频度接触24?48小时进行封孔修饰，离心、洗涤后，冷冻干燥即得控释型酵母细胞微胶囊产品。
[0044](5)如果需要，采用高效液相色谱法测定微胶囊中芯物质的含量。
[0045]在一个具体实施方案中，所述的阳离子聚合物为高分子量壳聚糖(CS，分子量为?
1.5X 105，脱乙酰度>90%，浙江玉环化工厂)，所述的溶液为1% HAc溶液。
[0046]在另一个具体实施方案中，微胶囊的封孔修饰步骤如下:在Ig酵母细胞与I?20mL I %的阿维菌素乙醇溶液在20?40°C的温度下高频度接触24小时完成包埋后，加入高分子量壳聚糖(分子量为?1.5X105，脱乙酰度>90%，浙江玉环化工厂)溶液使其最终浓度为0.1?2%，继续高频度接触24小时，离心，用水洗涤除去表面未包埋的阿维菌素和多余的壳聚糖后，冷冻干燥。
[0047]本发明的第四个目的