用于操纵液滴中的样品的系统的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关专利申请
[0002] 本申请涉及本申请者的共同待决的未公开的以下专利申请：2011年7月22 日的US13/188, 584 ;2012 年 6 月 29 日的EP12 174 408. 0 ;2012 年 7 月 2 日的JP 2012-148654;以及，2012年7月23日的CN2012 10254865. 1，这些专利申请的全部内容通 过明确地参考用于所有目的而并入到本文中。
技术领域
[0003] 本发明涉及一种液滴操纵系统和一种盒，盒具有聚合物膜以用于操纵在聚合物膜 上的液滴中的样品。小液滴操纵系统可以包括这种盒、由基板支承的电极阵列和用于控制 个别电极选择和用于向它们提供个别电压脉冲用于通过电湿润来操纵液滴的中央控制单 JL〇
[0004] 在各种领域，特别是科研、药物筛选或，法医学和医疗诊断领域中完善地确定了对 于生物材料诸如组织样品或微生物，特别是核酸或蛋白质等的分析。发展了适当方法来用 于不同目的，每种方法需要特殊的反应试剂和装置的特殊集合来执行相应方法。然而，将现 有分析程序用于每种领域中存在的不同条件和要求仍然面临着挑战。例如在法医学中，通 常只能提供相对少量的待分析材料。此外，这种材料量相当低，给涉及的人员带来额外挑 战。因此，程序需要具体地适应这些条件。另一方面，对于实验室诊断程序而言，生物材料 通常以充分的量提供，但根据要解决的潜在问题而单独地采取所需方法。
[0005] 对于生物材料分析的第一步而言，需要本领域中熟知的方法。例如从犯罪现场 (在法医学中）或者从患者（用于诊断目的）收集相关材料。这些材料可以是组织样品（诸 如口腔黏膜细胞、毛囊）或者体液（诸如血液、唾液等）。然后这种起始材料需要进一步加 工来使得核酸或蛋白质可用于分析。通常，溶解步骤最初用于这些目的，涉及例如施加热、 特定酶活性和/或施加具体化学品。细胞溶解之后从额外细胞材料纯化相关的核酸或蛋白 质。在需要分析核酸的情况下，可以提议核酸扩增步骤来增加样品产率。核酸扩增通常由 聚合酶链式反应（PCR)来实现。这种方法允许使用序列特异引物而扩增具体预先限定的核 酸序列。取决于要解决的问题，扩增的材料必须通过测序而被进一步分析。
[0006] 随着这些方法的可靠性和简化的进步，例如通过使用套件，这些方法变成了这些 不同领域中的标准程序。以及随着对于基于分子水平的诊断不断增加的需求，对于相关样 品的自动化处理，始于初始生物样品直到最终分析，存在增加的需要。
[0007] 相关的现有技术
[0008] 自动化样品处置系统是本领域中众所周知的。一示例是来自本申请人（瑞士 TecanSchweizAG,Seestrasse103,CH_8708Mannedorf)的reedomEVO? 机器人工作站。 这种装置能允许在独立仪器中或者与分析系统自动连接地进行自动液体处置。这些自动化 系统通常需要更大量的液体（微升至毫升）来处理。它们也是不被设计成便携式的较大系 统。
[0009] 一种用来溶解和/或纯化生物样品的便携式装置从WO2007/061943已知。使用 布置于两侧上的电极在盒腔室内执行核酸的处理，因此通过电解、电穿孔、电渗透、电动力 或电阻加热来处理生物材料。盒还包括筛选基质或隔膜。通过使用充分的缓冲剂和其它试 剂，与施加电极组合，能在腔室内执行各种反应，并且所希望的产品例如可以被导向至收集 隔膜。如果分析核酸的序列，并行分析的序列数量限于探针数量。通常，能被处理的探针数 量限于相关仪器能并行检测的四个不同波长。盒本身可以放置于整合的系统内，整合的系 统包括所需的控制元件和能源。尽管这种盒提供至少部分地电子控制样品处理的系统，仍 然需要研宄者或技术实验室工作人员的干预。
[0010] 应对生物样品的自动化处理的其它方案源自微流体领域。这个技术领域大体上涉 及少量液体（通常呈微米级或纳米级形式）的控制和操纵。在通道系统中的液体移动是本 身已知的，例如受到固定装置中的微泵或者旋转实验室器具中的离心力控制。在数字微流 体系统中，限定的电压被施加到电极阵列的电极，使得个别液滴被定址（电湿润）。对于电 湿润方法的一般概述，请参看Washizu,IEEETransactionsonIndustryApplications, 第 34 卷，No. 4, 1998,和Pollack等人，Labchip, 2002,第 2 卷，96-101。简言之，电湿润 指使用微电极阵列（优选地被疏水性层覆盖）来移动液滴的方法。通过向电极阵列的电极 施加限定的电压，引起在定址电极上存在的液滴的表面张力变化。这导致在定址电极上小 滴接触角的显著变化，因此小滴移动。对于这种电湿润程序，已知布置这些电极的两种主要 方式：使用具有电极阵列的单个表面来引起液滴移动或者添加第二表面，第二表面与类似 电极阵列相对并且设置至少一个接地电极。电湿润技术的主要优点在于仅需要少量液体， 例如，单个小滴。因此能在显著更短的时间执行液体处理。而且，液体移动的控制完全可在 电子控制之下，导致样品的自动化处理。
[0011] 使用具有电极阵列的单个表面（电极的单平面布置）进行电湿润的液滴操纵装置 从美国专利No. 5, 486, 337已知。所有电极放置于载体基板的表面上，下放到基板内，或者 被不可湿润的表面覆盖。电压源连接到电极。通过向随后的电极施加电压来使小滴移动， 因此根据向电极的电压施加顺序来引导液滴在电极上方的移动。
[0012] 使用带有至少一个接地电极的相对表面的电极阵列对液滴移动进行微米级控制 的电湿润装置从US6, 565, 727 (电极的双平面布置）已知。这种装置的每个表面可以包括 多个电极。电极阵列的驱动电极优选地由位于每个单个电极边缘处的突出部布置成彼此相 互交错关系。两个相对阵列形成间隙。导向至间隙的电极阵列的表面优选地被电绝缘疏水 层覆盖。液滴定位于间隙中并且通过向定位于该间隙的相对位点上的多个电极连续地施加 多个电场而在单极填料流体内移动。
[0013] 在处理生物样品的情形下操纵液滴的这种电湿润装置的使用从美国专利申请 No. 2007/0217956Al已知。在这里建议例如通过热循环在印刷电路板上扩增核酸。通过在 参考电极与一个或多个驱动电极之间施加电势而在电极阵列上运输小滴。样品放置于印刷 电路板上的储集器内，并且小滴在印刷电路板上分配。
[0014] 然而，上文所提到的装置都不允许完全自动地处理核酸，以较小体积规模从收集 的材料开始直到最终分析。所提出的装置的额外缺点是由于电极阵列的这种布置的性质， 通常生产起来较为昂贵，因此在使用中是不是一次性的。然而，对于不同的生物样品和应用 持续地再使用相同装置带来交叉污染相关样品的风险，这将导致错误的结果。因此，这些装 置不适合于高处理量的化验。
[0015] 带有聚合物膜以操纵聚合物膜上的液滴中的样品的容器从W02010/069977A1已 知：生物样品处理系统包括用于较大体积处理的容器和平坦聚合物膜，平坦聚合物膜具有 下表面和疏水性上表面。平坦聚合物膜由突起保持离容器的底侧一定距离。当容器定位于 膜上时，这个距离限定至少一个间隙。液滴操纵仪器包括用于引起液滴移动的至少一个电 极阵列。支承至少一个电极阵列的基板也公开为用于液滴操纵仪器的控制单元。容器和膜 可逆地附着到液滴操纵仪器上。该系统因此允许至少一个液滴从至少一个井状结构通过容 器的通道移位到平坦聚合物膜的疏水性上表面上并且到至少一个电极阵列上方。液滴操纵 仪器通过电湿润而实现了对于平坦聚合物膜的疏水性上表面上的所述液滴的引导移动的 控制和在那里处理生物样品。
[0016] 发明目的和概要
[0017] 本发明的目的在于提供一种带有电极阵列的替代液滴操纵系统，工作膜可以定位 于电极阵列上，液滴操纵系统被配置成操纵液滴中的样品并且对放置于电极阵列上的工作 膜上的这些样品进行光学检查。
[0018] 根据第一方面实现了这个目的，其中，提议包括基板和电极阵列的液滴操纵系统， 工作膜可以定位于电极阵列顶部上以操纵工作膜上的液滴中的样品。本发明的液滴操纵系 统包括基板，基板带有至少一个电极阵列和中央控制单元，中央控制单元用于控制（一个 或多个）电极阵列的个别电极的选择和通过向电极提供个别电压脉冲以通过电湿润来操 纵液滴。本发明的液滴操纵系统的特征在于其被配置成在电极顶部上接纳工作膜以在工作 膜放置于所述（一个或多个）电极上时利用（一个或多个）电极阵列来操纵液滴中的样品， 并且液滴操纵系统的（一个或多个）电极阵列的至少一个选定个别电极被配置成由光学检 测系统的光穿透以对位于工作膜上的液滴中的样品进行光学检查或分析。
[0019] 替代地，工作膜可以由盒包括，盒将放置于电极阵列上，或者工作膜可以单独地设 置于电极阵列顶部上。
[0020] 根据第二方面实现了这个目的，其中提出了一种液滴操纵系统，其包括基板和电 极阵列，带有工作膜的盒可以定位于电极阵列顶部上以在盒的工作膜放置于电极阵列上时 利用电极阵列来操纵液滴中的样品。盒的特征在于其包括：
[0021] a)主体，其包括上表面、下表面以及多个井状结构，井状结构被配置成在其中保持 试剂或样品；
[0022] b)可柔性变形的顶部结构，其不可渗透液体并且被配置成密封井状结构的顶侧；
[0023] c)可刺穿的底部结构，其不可渗透液体并且被配置成密封井状结构的底侧；
[0024] d)工作膜，其位于主体的下表面下方，工作膜不可渗透液体并且包括疏水性上表 面；
[0025] e)周围间隔件，其位于主体的下表面下方并且将工作膜连接到主体，；
[0026] f)在主体的下表面与工作膜的疏水性上表面之间的间隙，间隙由周围间隔件限 定；以及
[0027] g)多个刺穿元件，其位于可刺穿的底部结构下方并且被配置成刺穿该可刺穿的底 部结构以从井状结构向间隙内释放试剂或样品。
[0028] 在每种情况下从附属权利要求得到额外和创新性特点。
[0029] 根据本发明的盒的优点包括：
[0030] ?液滴操纵系统可以用来在对被操纵或保持在工作膜上的适当位置的液滴中的样 品执行分析时进行顶部和/或底部读取，即使在液滴位于两个表面之间的间隙中时。
[0031] ?利用液滴操纵系统的电极阵列的至少一个选定个别电极，可以由光学检测系统 的光来辐照位于电极上的工作膜上的液滴中的样品，电极在光学上是透明的或者是带有通 孔的光学通路电极。
[0032] 光学透明电极或光学通路电极可以位于电极阵列的任何位点，例如，在电极路径 内或者在液滴操纵系统的网格状电极阵列内。
[0033] ?盒被设计成物理地匹配许多不同的化验并且因此是多种不同化验通用的。
[0034] ?一次性盒被设计成仅单次使用并且被设置为预先加载数目和量足以用于计划的 化验的制备处理液体和/或试剂。
[0035] ?盒被设计成安全地吸收样本诸如口腔拭子头、组织或吸墨纸片，液体样品诸如血 液等。
[0036] 电极阵列与盒完全分离并且可以很多次再使用。
[0037] ?电极阵列优选地根据待执行的试验而具有变化的设计。
[0038] ?电极阵列并未由样本材料、样品或试剂触及并且因此一直是清洁的。
[0039] ?利用根据本发明的盒和系统，单个样品可以分成多个液滴。这允许：
[0040] ?单个小滴的个别操纵：
[0041] ?在这些小滴中每一个中执行单独反应；
[0042] ?不同地并且个别地处理每个小滴；例如，可以执行核酸扩增并且可以分析每个小 滴中的核酸中的不同单核苷酸多态性（SNP);
[0043] ?样品小滴中的某些可以处理以核酸分析并且来自同一样品的其它小滴可以被提 供用于免疫测定或参考样品。
【附图说明】
[0044] 现将借助于附图，更详细地解释根据本发明用于操纵液滴中的样品的盒和系统， 附图示出了本发明的优选示例性实施例并且并不计划用于缩小本发明的范围。在附图中示 出了：
[0045]图1是根据第一实施例的框架结构盒的竖直截面图，具有被底部部分闭合的中央 开口，具有多个井状结构和由单独周围间隔件接触的工作膜；盒几乎与系统的电极阵列接 触以进行液滴操纵；
[0046] 图2是根据第二实施例的板状结构盒的竖直截面图，具有多个井状结构和由整合 周围边沿接触的工作膜；盒几乎与液滴操纵系统的电极阵列接触；
[0047] 图3是根据第三实施例的框架结构盒的竖直截面图，具有跨主体的中央开口，具 有多个井状结构和由单独周围间隔件接触的工作膜；盒几乎与液滴操纵系统的电极阵列接 触；
[0048] 图4是根据图3的实施例的框架结构盒的竖直截面图；盒与液滴操纵系统的电极 阵列接触；一个井状结构的周围底部结构打开并且其内含物中的某些被压入到工作膜与覆 盖层之间的间隙内；
[0049] 图5是根据第四实施例的框架结构盒的竖直截面图，具有跨主体的中央开口，具 有多个井状结构和由单独周围间隔件接触的工作膜；盒与液滴操纵系统的电极阵列接触； 一个井状结构的可刺穿底部结构是打开的并且其内含物中的某些被压入到工作膜与覆盖 层之间的间隙内，覆盖层在此处被配置成刚性覆盖物；
[0050] 图6是根据第三实施例或第四实施例的框架状盒的三维顶视图，其中吸入装置处 于被