多孔性吸附介质，含有该介质的吸附装置和层析系统的制作方法
【专利说明】多孔性吸附介质，含有该介质的吸附装置和层析系统
[0001 ]本申请为一项发明专利申请的分案申请，其母案的申请日为2008年8月14日、申请 号为200810171406.0、发明名称为"多孔性吸附介质，含有该介质的吸附装置和层析系统"。
[0002] 本申请优先权为2007年8月14日提交的U. S.临时申请系列no. 60/964653和2008年 3月25日提交的U.S.临时申请系列no.61/070708,其通过参考文献并入本申请。
【背景技术】
[0003] 本申请涉及基于聚合性伯胺的阴离子交换层析介质，包括那种介质的阴离子吸附 器，以及包括这种吸附器的层析系统。吸收指的是通过渗透到吸附材料的体内吸收物质。吸 附指的是分子从体相运动到吸附介质的表面上。吸附作用是包括吸附和吸收的总称。同样 的，这里的吸附材料或吸附装置表示吸附器，指的是吸附或吸收、或者吸附和吸收的材料或 装置。这种介质特别应用为用于流通模块的多孔性膜吸附器以及更特别的不含单独外室的 模块。
[0004] 强的阴离子交换器，例如那些基于季铵盐的阴离子交换器，作为抛光介质用于下 游过程以捕获带负电荷的大型杂质，例如内毒素、病毒、核酸和宿主细胞蛋白质(HCP)，它们 存在于流体例如生物流体，特别是人造生物治疗剂的溶液中。习惯上，阴离子交换器以小球 的形式提供和使用，例如从GE Healthcare Bio-sciences AB商购获得的Q Sepharose1"。但 是小球基系统的生产量限制需要大体积的柱子以便有效的捕获杂质。
[0005] 在小球基的层析中，大部分可用于吸附的表面积在小球的内部。因此，由于传质速 率典型的被孔隙扩散所控制，分离过程实质上很缓慢。为了使这种扩散抵抗性最小化且伴 随着最大化的动态结合容量，可以使用小直径的小球。但是，小直径小球的使用在提高了价 格的同时使柱压下降。因此，制备层析分离的最优化通常包括在效率/动态容量(小型小球 易出现)和柱压下降(大型小球易出现)之间折衷。
[0006] 相反，膜基层析系统(还称为膜吸附器)具有直接与对流膜孔隙相连的配体，由此 消除了传质上内部孔隙扩散的影响。此外，与有效的流动分配器结合使用的具有致密的孔 隙尺寸分布的微孔膜基质的使用可以使轴向分散最小化，并提供所有活性位点的均一利 用。因此，膜吸附器介质的传质速率会比标准的小球基层析介质高一个数量级，这便允许了 高的效率和高通量分离。由于单一的或甚至堆叠的膜与用小球基介质堆积的柱子相比是非 常薄的，发现沿着层析床的压力降减小了，从而使得流动速率和生产率增加。通过使用具有 足够内表面积的膜，生产具有非常大的直径与长度比（d/h)外形的装置来达到必要的结合 容量。
[0007] 设计合适的膜吸附器具有比标准预制的小球基树脂好10-100倍的层析效率。因 此，为了在膜吸附器上获得相同水平的分离，可以使用打10次折以下的床高。对于膜吸附器 来说，与10-30cm床高的小球基系统相比，1-5_的床长是标准的。由于大体积的膜吸附器要 求极端的柱形比例，装置的设计是关键性的。为了保持与膜吸附器相关联的内在行为的优 势，要求适当的进口和出口分配器以高效地且有效地利用获得的膜体积。膜吸附器技术理 想的适用于这一应用。但是现在的膜吸附器有各种各样的缺点，包括低的结合强度，在去除 病毒、内毒素和核酸方面所表现出的难度。
[0008] 当后者流动通过它的孔隙时，高多孔性的、介质相互连接的膜吸附器具有除去(吸 附和/或吸收)一些溶液组分的能力。膜吸附器的这种性质和它在必需的应用中表现良好的 能力取决于介质（骨架）的孔隙结构以及暴露于溶液中的表面的性质。典型的，首先由不溶 于水或在水中溶胀的聚合物形成多孔性介质，且其具有可接受的机械性质。多孔性介质优 选为通过现有技术公知的相分离方法制备的多孔性膜片。参见，例如Zeman LJ，Zydney AL， Microfiltration and Ultraf iltration:Principles and Applications ?NewYork: Marcel Dekker，1996。中空纤维和管状膜也是可接受的骨架。通常要求分离处理步骤以改 性形成的多孔性结构的外部或正面表面以及内部孔隙表面以便赋予其必要的吸附特性。因 为膜结构经常由疏水性聚合物形成，表面改性步骤的另一个目的在于使表面成为亲水性的 或水可润湿的。
[0009] 这里存在着大量的改性膜的外部或正面表面以及内部孔隙表面的方法。那些本领 域的技术人员将会容易的认识到具有代表性的方法，包括吸附、等离子氧化、原位自由基聚 合、接枝和涂布。这些方法的大多数都导致在膜的表面上相成类似单层的结构，这在大多数 时候获得了使其亲水的目标，但是却不能赋予其可接受的吸附特性，例如对于被吸附物的 高容量。这一容量定义为可以被给定的介质体积保留的被吸附物的量(重量）。既然吸附发 生在膜的表面，这一容量将会受到膜表面积的限制。由于它们的特性，微孔膜与层析小球相 比具有较低的表面积。一种增加其表面积的方法为降低孔隙尺寸，这明显的导致失去大量 的通量。例如，不考虑表面相互作用的类型，在〇 .65μηι聚乙稀膜(Entegris Corp，Billerica ΜΑ)上蛋白质吸附的最大值(单层)为大约20mg/ml。这远远少于例如琼脂糖层析小球，其典 型的容量为大约80mg/ml。
[0010] 推动吸附的表面相互作用的类型是通过其中所使用的给定的膜吸附器产品的特 定应用定义的。现在，存在着从单克隆抗体(MABs)的溶液中除去病毒、核酸、内毒素和宿主 细胞蛋白质(HCPs)的高容量、高亲合力吸附器的需要。这些杂质倾向于具有比MABs更低的 等电点，这就意味着在某一pH值下它们将会是负电性的而MAB降是正电性的。要求用阴离子 交换器，即承载正电荷并且吸引阴离子的介质除去这些杂质。许多化学成分在水溶液中都 带有正电荷，包括伯、仲和叔胺以及季铵盐。这些胺在pH值低于11时都是正电性的，而季铵 盐在所有pH值下都带有正电荷，因此这些基团通常分别被称为弱的或强的阴离子交换器。
[0011] 阴离子交换器具有多个吸引并保留多种杂质和污染物的正电性结合位点。可以潜 在除去的杂质的量是膜上这些结合位点浓度的函数，且由于配体的化学特性（以及这些配 体的浓度)决定了其对不同杂质的结合强度。高强度的结合是对提高杂质，例如宿主细胞蛋 白质，去除的关键性贡献。结合强度(SB)涉及洗脱结合的杂质所需要的溶液离子强度。膜吸 附器的SB(用传导单元衡量，mS/cm)按照如下方法测定。首先，使少量的被吸附物的溶液通 过膜吸附器以使被吸附物结合在膜吸附器上。第二，用增加梯度的无机盐，例如氯化钠，洗 脱膜吸附器。记录需要将被吸附物洗脱掉的洗脱溶液的最小传导性并将其定义为膜吸附器 的SB。通过增加吸附器的结合强度，可以使负电性杂质不可逆转的结合在膜吸附器上，由此 显著的提高了去除的功效。这对于从抗体流中除去宿主细胞蛋白质的弱结合种群是特别重 要的。
[0012] 常规的流通阴离子交换器典型地含有负责吸引和结合负电性杂质，却排斥正电性 产物分子的季铵盐配体。常识要求为了通过电荷的相互作用较强地与杂质结合，强的阴离 子交换器即在所有pH值都具有正电荷的阴离子交换器是必要的。而本发明证明了其它的方 式。本发明发现聚合性伯胺，优选为具有共价连接在聚合物主链上的伯胺的脂肪族聚合物、 更优选具有通过至少一个脂肪族基团共价连接在聚合物主链上的伯胺，优选为亚甲基基 团，较强的与除去电负性杂质的物质结合并且因此是优选的用于在膜吸附器的表面形成吸 附性水凝胶的材料种类。
[0013]单克隆抗体作为治疗和诊断试剂持续具有重要性。用于候选mABs的筛选杂种细胞 库的方法既耗时又费工。一旦表示出合适mABs的杂种细胞链建立起来，就必须发展纯化方 法学以制备足够的用于进一步表征的mAB。用于纯化的传统的方法包括使用蛋白质A或蛋白 质G亲合层析。使纯化的抗体除盐并在生物缓冲液中使用透析交换。如果多重mABs平行的进 行评价，全部的过程典型的需要几天来完成并且特别麻烦。
[0014] U. S.专利No.6090288教导了含有用于多肽和核酸分离的层析介质的氨基基团的 制备。其揭示了与强的阴离子交换配体相比，从弱阴离子交换配体中洗脱蛋白质需要更高 的离子强度。公开的分离介质的重要的结构特征在于"在距离氨基氮2到3个原子处存在羟 基基团或伯、仲或叔胺基团"。在这里，例如，我们指出纯聚烯丙胺聚合物的松散交联涂层并 不需要任何促进与蛋白质更高强度结合的额外基团。
[0015] U.S.专利No. 5304638教导了使用包含载有众多聚胺基团的水不溶性基体的分离 蛋白质的方法。其中一个实施例展示了制备聚烯丙胺改性的琼脂糖层析凝胶。但是5304638 发明没有认识到使用伯胺与使用仲胺和叔胺相比的重要性。没有与控制涂层厚度以最优化 吸附作用相关的或与用于稳定交联涂层相关的努力或描述。他们强调优选的氮原子对之间 的碳原子数不超过3个。他们介绍了一个基于聚胺基团的结构和pH计算的经验函数Q，且其 具有优选的至少1.5的值。在聚烯丙胺中，相邻最近的氮原子之间有5个碳原子，且用于它的 Q函数应当接近0.1。
[0016] U. S.专利No. 5547576教导了制备一种具有固定聚胺涂层并且可以用于从水溶液 中除去病毒的多孔性膜。涂层的制备包括首先在膜的表面接枝自由基，并且然后使自由基 与聚胺化合物反应。由于内在的复杂性，接枝改性经常是不切实际的：它们对自由基接枝的 特别的基质敏感，并且在制造环境中实施起来是