一种以硅胶为基质的凝集素高效亲和色谱材料的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及亲和材料的制备技术，主要为凝集素亲和材料的制备方法，涉及到间隔臂的合成，以及凝集素亲和材料的制备。
【背景技术】
[0002]蛋白质的糖基化是蛋白质翻译后修饰中最重要的修饰之一，生物体中50%以上的蛋白质是糖基化的，糖蛋白参与了细胞免疫，信号传导，蛋白质的翻译调控、癌症等生理过程，在生命体中起着重要的作用(Synthetic glycopeptides and glycoproteins astools for b1logy, Chem.Soc.Rev., 2005, 34, 58—68 ；Cancer glycan b1markers andtheir detect1n - past, present and future, Anal.Methods, 2014，6，3918-3936)。正因为疾病中存在着异常的糖基化现象(Elucidat1n of N-Glycosites Within HumanPlasma Glycoproteins for Cancer B1marker Discovery, Mass Spectrometry ofGlycoproteins, 2013，951，307-322)，如岩藻糖增多而唾液酸下降(Fucose and sialicacid express1ns in human seminal fibronectin and a 1-acid glycoproteinassociated with leukocytospermia of infertile men,Disease Markers，2011，31，317-325)，半乳糖的升高均与疾病相关(Differential Glycomics of EpithelialMembrane Glycoproteins from Urinary Exovesicles Reveals Shifts towardComplex-Type N-Glycosylat1n in Classical Galactosemia, Journal of ProteomeResearc,2012, 11，906-916)，所以分析蛋白质的糖基化可以为疾病的临床诊断提供一种方法。
[0003]亲和色谱是糖蛋白的分离分析中常用的一种方法。亲和色谱法的突出特点是可对天然生物活性物质进行高特效性的分离和纯化，具有高浓缩效应，可从大量样品基体中分离纯化出所希望获取的少量生物活性物质。这种特效性的产生，是由于在亲和固相基体上，键合连接了特异性的配位体。此配位体的特效官能团可与被分离的生物分子生成具有镶嵌结构的络合物，存在着特效、可逆的分子间相互作用，依据生物识别原理，再利用具有恰当组成、可使镶嵌络合物解离的流动相，经过简单的洗脱步骤，就可实现对目标分子的高纯度、高产率的分离。常见的富集糖蛋白的亲和色谱材料为特异性抗原抗体材料，凝集素亲和材料，硼亲和材料等。
[0004]凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。除红细胞外，还能凝集淋巴细胞、纤维细胞、精子等。常用的为植物凝集素。通常以其提取的植物命名，如伴刀豆素 A (Conconvalina, ConA)、麦胚素(Wheat germ agglutinin, WGA)、花生凝集素(Peanutagglutinin, PNA)和大豆凝集素(Soybean agglutinin, SBA)等，凝集素(Lectin)是其总称。凝集素在动，植物体内广泛存在。迄今为止，已发现的植物凝集素有1000多种。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白、糖脂、特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力。人们逐渐将发现的凝集素发展成强有力的工具来纯化、分离、分析糖蛋白，并将其用于分析组织、细胞和蛋白质的糖结构。
[0005]亲和色谱材料的制备及使用中存在的问题。(I)亲和色谱固定相有基体、间隔臂、配位体三部分构成。由于用作基体的载体材料种类繁多；间隔臂具有亲水或疏水性质、长度可以调节；配位体与目标分子作用机理模式多样，因此亲和色谱固定相的制备比其它色谱固定相的制备要复杂，不仅制备程序冗长，且每步键合反应后需检测键合效果，其总体制备成本也较高。(2)常见的亲和材料为凝胶基质，不耐高压，限制了其在高效亲和色谱中的应用，而采用硅胶基质的材料容易解决抗压的问题，但是惰性的材料表面仍然存在非特异性作用，材料表面的电荷作用影响生物大分子和基质间的相互作用。
[0006]为提高糖蛋白的分离纯化效率，高效亲和色谱方法集中液相色谱和亲和色谱的优势，基于在硅胶基质上的化学改性引入亲和配基而得到的高效亲和色谱材料，并将其应用于糖蛋白的分离分析及制备中，为糖蛋白药物的分离纯化提供了一种参考。
【发明内容】
[0007]针对凝集素亲和色谱材料制备路线冗长复杂，凝集素的活性不能够很好的保持所存在的问题，本发明提供一种高效制备凝集素亲和材料的方法，主要涉及亲和材料间隔臂的合成，凝集素亲和材料的合成过程。操作步骤如下:
[0008]硅胶预处理:硅胶加入体积浓度为I?36%的盐酸或硝酸溶液中，加热回流搅拌I?48小时，过滤，水洗至中性，在100?160°C干燥6?10小时，后在80°C干燥6?12小时至恒重；
[0009]间隔臂末端含有官能团的硅烷化试剂的制备:惰气保护下，室温，氨基烷氧基(三甲氧基或者三乙氧基)硅烷试剂溶于含有双官能团试剂的极性非质子性溶剂中，电磁搅拌4?6小时，得到一端含有烷氧基硅烷的官能团，另一端含有环氧、羧基、醛基、异氰基、羟基等官能团的硅烷试剂；
[0010]硅烷试剂改性硅胶固定相的制备:惰气保护，将步骤a处理好的硅胶溶于有机溶剂中，加入步骤b得到的硅烷化试剂，加热回流，反应16?48小时；反应体系冷却至室温，减压过滤，依次用甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，固体产品在60?100°C下干燥12?24小时，得到末端含有环氧、羧基、醛基、异氰基、羟基等官能团的硅胶固定相；
[0011]凝集素键合硅胶亲和材料的制备:惰气保护，将上述干燥的硅胶加入无水有机溶剂或者不含有一级氨基的缓冲盐溶液中，用活化试剂活化官能团，比如用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基官能团，反应2?4小时后，减压抽滤固定相，用不含有一级氨基的缓冲盐溶液洗涤固定相，迅速重溶于不含有一级氨基的缓冲盐溶液中；惰气气氛保护下，将凝集素溶解于有特异性结合的糖的不含有一级氨基的缓冲盐溶液，并加入上述经过官能团活化的硅胶缓冲盐溶液中，4?25°C搅拌4?24小时，然后加入含有一级氨基的试剂，对未反应完全的活化基团封尾2?4小时，离心；取上层清液，应用BCA方法测凝集素的浓度，下层固定相用缓冲盐溶液洗涤至上层清液中无蛋白质的吸收，得到键合有凝集素的硅胶亲和材料。
[0012]惰气气氛为氮气、氩气、氦气中的一种或二种以上；
[0013]无水有机溶剂为无水N，N- 二甲基酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，
[0014]中的一种或两种以上。
[0015]本发明与现有技术相比具有以下特点:
[0016]1.凝集素材料性能稳定，易于保存。将合成的凝集素填料，放于含有NaN3的缓冲盐溶液中，在4°C的冰箱中保存，可存放12个月；
[0017]2.操作简单，所用溶剂均是中性的缓冲盐溶液，对环境无污染；
[0018]3.亲和材料中凝集素的键合量高，为90-100mg/g，键合率为90-97% ;
[0019]4.键合强度高，所制备的凝集素亲和材料的耐受酸碱范围为4-8 ;
[0020]5.在应用的过程中凝集素