组织透明溶液及其应用的制作方法

本发明涉及一种可与光学显微镜一起使用的溶液，特别涉及一种可令生物材料(例如，动物组织或器官、或是生物工程胶原蛋白支架)变成透明的组织透明溶液。

背景技术：

虽然在图像处理时，可使用荧光追踪剂或重组荧光蛋白来标定细胞及细胞内的次级结构，但由于组织本身不透光，因此仅能撷取有限深度的组织影像。组织不透光性也是生物工程领域中一项为人关注的议题。组织工程中会大量使用诸如胶原蛋白支架这类的生物工程材料，来进行伤口重建或愈合。但是，胶原蛋白支架一般是不透光的，这也使得若要搭配使用光学显微镜于活体外检视这些胶原蛋白支架及其他可能与这些胶原蛋白支架反应的大分子和/或细胞时，变得不容易。传统上会将厚度大的样本切成薄片，以便以肉眼或仪器检视组织内各目标分子。之后，再透过3D方式重建影像，并从中获取相关信息。但是，这种重建过程往往效率不彰且结果不够精确。因此过去十年间发展出几种能够让生物材料变成肉眼「可看透(see-through)」的试剂，包括江安世所发明的FocusClear溶液(参见美国专利6,472,616 B1)、Miyawaki等人所发明的SCALEVIEW-A2溶液(参见美国专利公开号20130045503A1)，钟等人所发明的CLARITY技术(Nature(2013)497,332-337)和Hans-Urich Dodt等人所发明的苯甲醇-苯甲酸苯甲酯(BABB)溶液(Nature Methods(2007)4(4),331-336)。所有上述这些溶液或技术，在组织变成透明后都还能保存重组荧光蛋白的讯号，因此能有效地改善可撷取组织3D影像的深度。然而，上述这些溶液或技术仍有缺点。举例来说，FocusClear溶液会让生物样本体积缩小，且无法有效地让深度超过0.5微米的组织变成透明。SCALEVIEW-A2溶液则需要较长的反应时间，如从数周到数月，才能让组织透明；同时还会让组织体积膨胀，使得样本结构变得极端脆弱。此外，SCALEVIEW-A2溶液也无法让微小组织，例如昆虫脑部，变成透明。至于BABB溶液，则是会造成不可逆的组织萎缩，再者，由于BABB仰赖有机溶剂，因此也会让传统免疫荧光化学反应、传统亲脂性碳氰染料或荧光追踪剂(如霍乱毒素次单元B)中的荧光讯号被淬熄。至于CLARITY技术本身则繁琐耗时，费时数天至数周，还需要特制的设备(例如，电泳式组织透明设备)，方能让组织透明化。由于电泳式组织透明设备会将大部分细胞膜的脂质双层移除，因此，CLARITY技术的主要缺点是无法观察到样品完整的结构外貌。此外，CLARITY技术也无法让诸如胶原蛋白支架这种生物材料变成透明。尤有甚者，因CLARITY技术涉及使用丙酰胺这类已知具致癌及强力神经毒性的有毒成分，因此会伴随着有毒废弃物的生成。

本发明目的在于解决上述现有技术中的问题，并提供一种新颖的组织透明试剂，其可迅速令组织器官及生物材料透明，且使用上安全、便利。

技术实现要素：

本发明内容至少部分是基于意外发现由特定物质所组成的溶液，可令生物材料(例如，哺乳动物或昆虫的组织或器官，或是生物工程材料(例如，胶原蛋白支架))变成透明，因此可让原先已使用染料或荧光蛋白进行标定的生物材料，在组织透明化后仍可被追踪。

基于上述，本发明目的之一是提供一种可令生物材料变成透明的新颖溶液。此溶液的特征在于包含：

一具有式(I)结构的第一活性化合物

一具有式(II)结构的第二活性化合物

或所述具有式(I)结构的第一活性化合物和所述具有式(II)结构的第二活性化合物的组合；

一足够量的溶剂，以使该第一或第二活性化合物溶解于其中并形成该溶液；

其中：

R₁、R₂、R₃、R₄及R₈分别是氢或具有至少两个羟基取代基的C_1-6烷基；

R₅是有或无至少一个羟基-取代基的C_1-3烷基或-CH₂OCH₃；

R₆及R₇分别是乙酰基或C_1-3烷基；

X₁、X₂及X₃分别是一卤素，选自由氯、溴和碘组成的群组中；

Y是具有至少一个羟基取代基的C_1-3烷基或

该溶液的pH值小于11；且

该溶液的渗透压介于200至3,500mOSm/L间，此处的mOSm为毫渗透摩尔，简称毫渗，为渗透压单位。

较佳是，该溶液的pH值小于11；且该溶液的渗透压介于250至1,000mOSm/L间。

依据特定实施方式，上述具有式(I)结构的第一活性化合物可以是以下任一种：

依据其他特定实施方式，上述具有式(II)结构的第一活性化合物可以是以下任一种：

较佳是，上述具有式(I)或(II)结构的第一或第二活性化合物在该溶液中的浓度至少为10％(w/v)。

该溶液还可非必要的包含一种抗冻剂或是保湿剂。所述抗冻剂可以是糖、甘油或二甲基亚砜(DMSO)，且其在在该溶液中的浓度介于5％至30％(w/v)间。较佳是，当组织表面具有角蛋白时，所述抗冻剂是DMSO。保湿剂可以是玻尿酸或多元醇，且其在在该溶液中的浓度介于5％至30％(w/v)间。

本发明内容也涵盖一种能够可逆式地令生物材料变透明的方法。所述方法包含以下步骤：以上述本发明溶液来处理该生物材料一段足够长的时间，以使该生物材料变成透明。所述生物材料可以是哺乳动物或昆虫的组织或器官，或是一种以生物工程方式生产的胶原蛋白支架。所述生物材料原先已以染料或荧光蛋白之类的影像追踪物进行标定，使得在组织透明化后仍可于光学显微镜下追踪该生物材料上的影像追踪物。

下述附随图示绘示出本发明内容的一或多种实施方式。本发明内容的其他特征或优点可由发明详细说明中得知。

须知以上的说明和以下的详细说明及图示均为例示，用以阐述本发明概念，并非用以限制本发明范畴。

附图说明

下述图示为本说明书的一部份，且用以进一步证实本发明内容的某些实施例，在参照本说明书所示的特定实施方式并根据该些图示说明，将使本发明更明显易懂。

图1为各种生物材料依据本发明内容一特定实施方式处理后的照片，包括小鼠的脑、心脏、小肠、肝脏、肺脏、胰脏、胃和耳朵，苍蝇头部以及胶原蛋白膜；

图2为依据本发明内容一特定实施方式，先以凝集素-Alexa Fluor 488和碘化丙碇标定，再施以透明处理的小鼠小肠的共轭焦照片；

图3是依据本发明内容一特定实施方式，先以DilC₁₈(3)标定，再施以透明处理的小鼠脑部的共轭焦照片；

图4为是依据本发明内容一特定实施方式，先以酪胺酸羟基酶(TH)-Gal4标定，再施以透明处理，接着以抗-TH抗体进行免疫染色的苍蝇脑部的共轭焦照片；

图5是依据本发明内容一特定实施方式，让小鼠脑部自透明处理中恢复后的照片；

图6是依据本发明内容一特定实施方式，分别以本发明溶液、FocusClear溶液、SCALEVIEW-A2溶液或BABB溶液处理后的小鼠脑部体积变化的照片；及

图7是依据本发明内容一特定实施方式，分别以本发明溶液、FocusClear溶液、SCALEVIEW-A2溶液或BABB溶液处理后的小鼠脑部组织透明化的时间线图。

具体实施方式

下述伴随图式的说明的目的在于说明本发明内容，并非用以将本发明限于特定实施方式。

本发明内容大致是关于由特定物质所组成的溶液，可令生物材料(例如，哺乳动物或昆虫的组织或器官，或是生物工程材料(例如，胶原蛋白支架))变成透明，因此可让原先已使用染料或荧光蛋白进行标定的生物材料，在组织透明化后仍可被追踪。

基于上述，本发明目的之一是提供一种可令生物材料变成透明的新颖溶液。此溶液的特征在于包含：

一具有式(I)结构的第一活性化合物

一具有式(II)结构的第二活性化合物

或所述一具有式(I)结构的第一活性化合物和所述一具有式(II)结构的第二活性化合物的组合；

一足够量的溶剂，以使该第一或第二活性化合物溶解于其中并形成该溶液；

其中：

R₁、R₂、R₃、R₄及R₈分别是氢或具有至少两个羟基取代基的C_1-6烷基；

R₅是有或无至少一个羟基-取代基的C_1-3烷基或是-CH₂OCH₃；

R₆及R₇分别是乙酰基或C_1-3烷基；

X₁、X₂及X₃分别是一卤素，选自由氯、溴和碘组成的群组中；

Y是具有至少一个羟基取代基的C_1-3烷基或是

该溶液的pH值小于11；且

该溶液的渗透压介于200至3,500mOSm/L间。

除非另作说明，否则「烷基」一词在此是指具有1-20个碳原子(例如，1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1)的直链或支链碳氢化合物。具有1-4个碳原子的烷基称为「低碳数烷基」。烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正-丁基、第三-丁基、异丁基、2-异丙基-3-甲基丁基、戊基、戊烷-2-基、己基、异己基、庚基、庚烷-2-基、4,4-二甲基戊基、辛基、2,2,4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。除非另作说明，否则每一烷基都可非必要的包含有取代基，也就是说每一烷基可以有(有取代基的烷基)或无(没有取代基的烷基)一或多个取代基。当以「有取代基的」一词来描述一个化学结构或基团时，意思是指该化学结构或基团上的氢原子被另外一个原子、化学结构或官能基所替代，这些官能基包括但不限于，羟基、醛基、烷氧基、烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基、正-丁基、第三-丁基等)、卤素、-CH₂OCH₃-或是

依据一特定实施方式，上述具有式(I)结构的第一活性化合物可以是以下任一种：

依据其他特定实施方式，上述具有式(II)结构的第一活性化合物可以是以下任一种：

本发明溶液可透过以下方式制备：将具有式(I)或(II)结构的第一或第二活性化合物或其二者的组合与足够量的溶剂(如，水或盐溶液(如，生理食盐水、PBS、HBSS等))混合，并搅拌至每一化合物完全溶解于该溶剂中为止。具有式(I)或(II)结构的第一或第二活性化合物或其二者的组合在溶液中的用量，端视所欲处理的生物材料的厚度而定。一般来说，对于厚度较低的生物材料来说，所需该具有式(I)或(II)结构的第一或第二活性化合物或其二者的组合的用量会较少，反之，若生物材料的厚度较高，就须增加该具有式(I)或(II)结构的第一或第二活性化合物或其二者的组合的用量。一般来说，本发明溶液所能处理生物材料的厚度高达5毫米，且具有式(I)或(II)结构的第一或第二活性化合物在该溶液中的浓度较佳是至少为10％(w/v)。一旦该具有式(I)或(II)结构的第一或第二活性化合物或其二者的组合已完全溶解于溶剂中后，即可调整其pH值与渗透压。本发明溶液的pH值较佳是小于11，例如10、9、8、7、6或5；更佳是小于9，例如8、7、6或5；最佳是介于6至9之间。本发明溶液的渗透压较佳是介于200至3,500mOSm/L间；更佳是介于220至2,000mOSm/L间；最佳是介于250至1,000mOSm/L间。

本发明溶液还可非必要的包含一种抗冻剂或是保湿剂。所述抗冻剂可以是糖(如，葡萄糖、果糖、海藻糖或蔗糖)、甘油或二甲基亚砜(DMSO)，且其在在该溶液中的浓度介于5％至30％(w/v)间。较佳是，当组织表面具有角蛋白时，所述抗冻剂是DMSO。保湿剂可以是玻尿酸或多元醇(例如，三元醇、甘油或山梨醇)，且其在在该溶液中的浓度介于5％至30％(w/v)间。

本发明内容也涵盖一种能够让生物材料变透明的方法。所述方法包含以下步骤：以上述本发明溶液来处理该生物材料一段足够长的时间，例如至少0.1、0.5、1、2、3、4、5或6小时，较佳是至少0.5、1、2、3、4、5、6或7天，以使该生物材料变成透明。所述生物材料可以是植物或动物的组织或器官，较佳是动物的组织或器官，例如昆虫、鱼、两栖动物、鸟、和哺乳动物；更佳是哺乳动物的组织或器官。所述哺乳动物包括，但不限于，诸如小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠和除人类以外的灵长类等实验用动物；诸如狗、猫类的宠物动物；诸如牛、马、羊等农场动物；和人类。较佳是来自哺乳动物的组织或器官。依据本发明一特定实施方式，所述生物材料是小鼠的脑、心脏、小肠、肝脏、肺脏、胰脏、胃和耳朵，苍蝇头部或是以生物工程方式制造的胶原蛋白膜。

所述生物材料在透明化处理前可先以染料(如，碘化丙碇或长链脂肪性碳氰化物染料)、荧光蛋白(如，酪胺酸羟基酶(TH)-Gal4)或抗体(如，抗酪胺酸羟基酶抗体)之类的影像追踪物进行标定，使得当该生物材料被施以本发明的透明化处理后，仍可于光学显微镜下追踪该生物材料上的该影像追踪物。本发明的透明化处理较佳是在室温(约25℃)至约50℃的温度下实施。

此外，本发明的透明化处理乃是一种可逆式过程，代表当经过本发明的透明处理而变成透明的生物材料(也即，经过本发明溶液处理一段足够长的时间而变成透明的生物材料)，被浸泡在适当缓冲溶液中一段时间，使得原先被吸附或包埋在生物材料中的该具有式(I)或(II)结构的第一或第二活性化合物或其二者的组合被释出到缓冲溶液中，后将可再次恢复到原先不透明的状态。可达成这种恢复不透明状态的缓冲液或盐溶液包括任何一种具平衡浓度的盐溶液(如，PBS、HBSS或TBS)、人工脑脊髓液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)、和细胞培育基质(例如，非必要胺基酸溶液(MEM)、Dulbecco氏DMEM、和Ham氏F-12)。在一较佳实施方式中，将一透明生物材料(如，小鼠的小肠)浸泡在PBS溶液中约1小时后，该生物材料即又恢复到原先不透明状态。此外，以本发明溶液进行透明处理，并不会让生物材料中的蛋白质失去其抗原性质，意思是说变成透明的生物材料中的蛋白质在经过恢复过程后，会再度恢复到其未经透明处理前的状态。

尽管此处采用约略的数值来界定本发明较宽范围的数值范围与参数，但已尽可能精确地记载特定实验例中的数值。然而，任何数值不可避免地包含了因为个别试验、测量方法中可能会产生的标准偏差所导致的误差。此外，本文所述的「约(about)」一词通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，「约」一词代表实际数值落在平均值的可接受标准偏差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过「约」的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。

除非另有所指，否则此处及附随的申请专利范围所用之「一(“a”或”an”)」及「该(“the”)」皆包含其复数形式。

以下将透过实验例说明本发明内容，该些实验例仅为了阐述本发明，而非用以限定本揭示内容的范围。本说明书中所公开的技术特征可以任何形式加以组合应用。各技术特征可以能用以达到相同、相等或相似的替代方法加以替换。

实施例

材料与方法

透明处理

先以内含4％多聚甲醛的冰冷的磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)来处理待测者(如，来自昆虫或小鼠)，使其被系统性地固定。接着，以适当工具小心地从待测者身上将想要进行透明处理的组织或器官，例如脑、心脏、胃脏、胰脏、小肠、肝脏、肺脏、耳朵或头部等(以下称为「样本」)取出，并浸泡在上述冰冷的固定液中，同时在4℃下于震荡器上轻轻地摇晃隔夜。接下来，在1小时的时间内，于室温下以内含0.5％Triton X-100的磷酸缓冲液(PBST)清洗样本3次，整个充满清洗过程都是在震荡器上进行，并轻轻地摇晃样本。进行透明处理时，先将样本转移到充满实施例1的透明处理溶液的工作隔室中，并将样本浸泡在其中。接着，以纸巾或盖玻片覆盖工作隔室，使得工作隔室中的溶液不会挥发至干，同时须避光。接着，将工作隔室放置在震荡器上，并于35℃下轻轻地摇晃2-12小时(时间长短端视样本的厚度而定)，直到样本变成透明为止。接着，在工作隔室中加入新鲜的透明处理溶液，并以Neo-Mount(Merck)将工作隔室密封，等待1小时后即可放在显微镜下观察。

实施例1制备本发明的组织透明溶液

本发明可令组织透明的溶液是依据表1所示配方，在室温下将各组成分于溶剂中混合溶解后而制成。

表1组织透明溶液配方

实施例2经过实施例1的组织透明溶液处理后的各生物材料的显微影像

2.1本发明溶液可使源自啮齿动物或昆虫的组织或器官透明化

依据材料与方法中揭示「透明处理」的步骤，将小鼠的脑、心脏、胃脏、胰脏、小肠、肝脏、肺脏、和耳朵、苍蝇头部，和以生物工程方式制成的胶原蛋白支架分别浸泡在实施例1的配方2溶液中，使变成透明。结果示于第1图的照片中。如第1图的照片所示，实施例1揭示溶液确实可有效地使源自小鼠或昆虫的组织或器官，或是胶原蛋白支架变成透明。

2.2透明化处理不会影响预先以有机染料标定的小鼠小肠的荧光讯号

在此实施方式中，小鼠小肠在接受透明处理前已事先以荧光染料进行标定。

简言之，先以凝集素-Alexa Fluor 488共轭物(购自Invitrogen,USA)对小鼠进行标定，接着如「材料与方法」所述步骤，透过心脏盥洗方式以内含4％多聚甲醛的冰冷的磷酸缓冲液进行系统性固定。然后，将小鼠小肠取出，以N-乙酰-L-半胱胺酸溶液(0.4N)移除小肠中物质，以0.5％PBST清洗3次后，于室温下在震荡器上以1.0％PBST震荡隔夜以对小肠进行通透化处理。接着，于4℃下让小肠与碘化丙碇(PI,50μg/mL)溶液作用约30-60分钟，再于室温下以0.5％PBST清洗小肠3次，然后依照「材料与方法」所述步骤，以实施例1中配方2的透明溶液对小肠进行透明化处理。第2图为将此透明处理后的小鼠小肠共轭焦照片，可在传统荧光显微镜下分别观察到凝集素-Alexa Fluor 488共轭物与碘化丙碇的荧光讯号，代表以本发明透明溶液对组织施以透明化处理，并不会影响原先以染料或重组荧光蛋白标定的组织的荧光讯号。

2.3透明化处理不会影响预先以亲脂性细胞膜染料标定的小鼠小肠的讯号

在此实施方式中，小鼠小肠在接受透明处理前，已事先以一种可水平扩散并标定整个细胞的长链亲脂阳离子型吲哚羰花青荧光染料进行标定。

简言之，依据「材料与方法」所述步骤将小鼠小肠固定，再依实施例2.2所述步骤移除小肠中物质，接着以0.5％PBST清洗3次后，于室温下在震荡器上于相同溶液中震荡隔夜，以对小肠进行通透化处理。接着，于室温下让小肠与DilC₁₈(3)(1,1’-二(十八烷基)-3,3’,3’,-四甲基吲哚羰花青过氯酸酯,1μg/mL)溶液作用隔夜，再于室温下以PBS清洗小肠3次，然后依照「材料与方法」所述步骤，以实施例1中配方2的透明溶液对小肠进行透明化处理。第3图为将此透明处理后的小鼠小肠共轭焦照片。

2.4透明化处理不会影响预先以抗-酪胺酸羟基酶(TH)抗体及荧光蛋白标定的苍蝇脑部的讯号

在此实施方式中，小鼠小肠在接受透明处理前，已事先以一种荧光染料及抗-TH抗体进行标定。

简言之，将苍蝇头部切下浸泡在内含4％多聚甲醛的冰冷的磷酸缓冲液中，然后微波处理(2,450MHz,1,100瓦)约90秒(伴随连续旋转)，重复此微波处理3次。在室温下以1％PBST和10％正常山羊血清清洗约30分钟，然后真空脱气(在真空室中将压力减少至270mmHg并维持该压力10分钟，以移除组织中的空气)。重复此真空脱气处理6次。于4℃下以1％PBST和10％％正常山羊血清处理苍蝇头部隔夜，然后以1:100的小鼠抗-TH单株抗体溶液处理，接着于4℃下以1:250有生物素标定的山羊抗小鼠IgG二次抗体处理约2天。以1％PBST清洗3次后，再于4℃下以1:500的Alexa Fluor 635链霉亲和素处理脑部隔夜。经过密集清洗后，将脑部组织转移到一盛装有实施例1(配方1)透明溶液的工作腔室中，让脑部组织浸泡在其中约3分钟。接着，以盖玻片覆盖腔室，并以Neo-Mount(Merck)将腔室密封，避光约1小时或直到Neo-Mount完全干燥为止。第4图为以胺酸羟基酶(TH)-Gal4标定，再施以透明处理，接着以抗-TH抗体进行免疫染色的苍蝇脑部的共轭焦照片。

实施例3复原经透明化处理后的组织

在此实施方式中，依据实施例2.1所述方式将小鼠小肠固定并进行透明处理，接着，将小肠移回到PBS中，浸泡约1小时候，可看到小肠组织逐渐由透明恢复到不透明状态(第5图)。

实施例4以其他透明溶液处理组织的比较实验例

4.1组织容积变化

在此实施方式中，是以实施例1的本发明透明溶液与其他几种已知可使组织透明的溶液，包括，FocusClear溶液(参见美国专利6,472,616 B1)、SCALEVIEW-A2溶液(参见美国专利公开号20130045503A1)、和苯甲醇-苯甲酸苯甲酯(BABB)溶液(参见Nature Methods(2007)4(4),331-336)，来处理小鼠脑部，然后分别测量经各溶液处理后，小鼠脑部体积变化的情形。

为了测量在透明化处理后，组织膨胀和/或收缩的情况，将厚度约1毫米的小鼠脑部分别浸泡在实施例1的本发明透明溶液(配方2)、FocusClear溶液或SCALEVIEW-A2溶液中约7天，BABB溶液中约5天；然后测量组织体积改变的多寡。结果显示在第6图中。

可观察到以本发明透明溶液(配方2)处理过的小鼠脑部，体积并没有明显改变；相反的，以FocusClear溶液处理后的小鼠脑部，体积缩减约5％；以BABB溶液处理，体积缩减程度则高达约35％。至于，SCALEVIEW-A2溶液则会使脑组织体积出现140％的线性膨胀。

4.2组织透明速率

在此实施方式中，比较了各透明溶液，包括实施例1的本发明透明溶液(配方2)、FocusClear溶液、SCALEVIEW-A2溶液和BABB溶液，使组织透明的速率。透明程度是以组织在633nm下的透光百分比来表示，结果示于第7图中。

如第7图所示，本发明实施例1的透明溶液使组织透明的速率最快，约70％的组织在透明化处理约3小时后即已转成透明。透明化速率第二快的则是FocusClear溶液，约40％的组织在透明化处理约2小时后即已转成透明。SCALEVIEW-A2溶液造成组织透明的速率最慢，经过7天处理仅有约30％的组织变成透明。至于BABB溶液则是拥有全部透明或全部不透明的效果，约70％的组织在透明化处理1天后即已转成透明。

总结来说，相较于已知的透明溶液来说，本发明实施例1的透明溶液拥有最佳的组织透明效果，其透明化后所引起的体积变化最小，具有最快速的初始透明化速率，以及与其他已知透明化溶液不相上下的透明化效果。

当可理解上述实施方式与实施例仅为例示，且熟习此技术者可对其进行各种修饰。上文提出的说明书、实施例与数据的目的在于使本说明书的结构完备，并作为实作本发明的例示。虽然本发明内容已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明内容，任何熟习此技术者，在不脱离本发明内容的精神和范围内，当可作各种的更改与润饰，因此本发明内容的保护范围当根据后附的申请专利范围所界定者为准。当可理解上述实施方式与实施例仅为例示，且熟习此技术者可对齐进行各种修饰。上文提出的说明书、实施例与数据的目的在于使本说明书的结构完备，并作为实作本发明的例示。虽然本发明内容已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本揭示内容，任何熟习此技术者，在不脱离本揭示内容的精神和范围内，当可作各种的更改与润饰，因此本揭示内容的保护范围当根据后附的申请专利范围所界定者为准。