用荧光免疫层析技术检测真菌毒素的试纸条和方法与流程

本发明涉及纳米材料技术、免疫学技术、侧流层析技术等领域。更具体的，本发明涉及一种用荧光免疫层析技术检测真菌毒素的试纸条；此外，本发明还涉及一种用荧光免疫层析技术来检测真菌毒素的方法。

背景技术：

粮食饲料在收获时未被充分干燥或贮运过程中温度或湿度过高，就会使带染在粮食饲料上的真菌迅速生长，真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物叫真菌毒素。真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、玉米赤霉烯酮、单端孢霉烯族镰刀菌毒素（T-2毒素）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）、赭曲霉毒素A、伏马毒素、展青霉素、玉米赤霉醇等。许多国家在玉米、花生及花生油、花生饼、花生酱、棉籽饼、山核桃、无花果、榛子、可可豆、杏仁、奶粉、牛奶、水牛奶、酸奶、奶酪、大米等都曾查出黄曲霉毒素。真菌毒素对人类和动物都有害，如黄曲霉毒素或玉米赤霉烯酮会使人致癌或不孕、流产。镰刀菌毒素急性中毒会引起全身痉挛、心力衰竭死亡，慢性中毒常会引起胃炎、恶心、口、鼻、咽及消化道出血等。因此，有必要对饲料、面粉、大米、大豆、奶的原料和加工产品都进行这些真菌毒素的监测。

目前检测真菌毒素的方法主要有色谱法、质谱法、酶联免疫分析法（ELISA）以及胶体金免疫层析法。其中色谱法、质谱法、ELISA都要用到昂贵的设备，需要专业技术人员在实验室中操作，而且操作步骤多，耗时长。胶体金免疫层析法则操作简单、方便、快速且便宜，但是其灵敏度较低，而且不能定量检测。因此有必要提供一种快速、方便、简单且高灵敏度的真菌毒素定量检测方法。

技术实现要素：

本发明旨在解决本领域中的上述各种问题和实现以下目标。具体地，本发明的目的就是要提供一种方便、快速而且高灵敏度地检测样品中的真菌毒素的试纸条和方法。

具体的，本发明提供了一种用荧光免疫层析技术检测样品中的真菌毒素的试纸条。

在一种实施方式中，本发明提供了一种用免疫层析技术检测真菌毒素的试纸条，包括标记物垫和捕获膜，其特征在于，所述标记物垫含有荧光微球标记的真菌毒素抗原，所述捕获膜含有真菌毒素检测抗体。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述荧光微球是时间分辨荧光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述时间分辨荧光微球是含铕复合物的微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是黄曲霉毒素。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是玉米赤霉烯酮。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是呕吐毒素。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是赭曲霉毒素A。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是T-2毒素。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是伏马毒素。

在另一种实施方式中，本发明提供了一种用免疫层析技术检测真菌毒素的方法，其特征在于，在权利要求1所述的试纸条样品垫上滴加含真菌毒素的样品，反应后检测荧光信号。

详细说明

用免疫层析技术检测样品中真菌毒素的试纸条如图1示，包括样品垫1，标记物垫2，捕获膜3，吸水垫4，支撑底板5。捕获膜3上含有C线6和T线7。

其中样品垫一般为玻璃纤维、滤纸或滤血膜。标记物垫可为玻璃纤维、滤纸或聚酯膜。当样品垫和标记物垫材质相同时可整合在一起，用一条玻璃纤维、滤纸或聚酯膜来完成样品垫和标记物垫的功能。所述标记物垫含有荧光微球标记的真菌毒素抗原，还可以含有荧光微球标记的对照蛋白或抗体，如链亲和素或兔抗体（兔IgG）。

捕获膜可以是硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜等，所述捕获膜的T线含有真菌毒素检测抗体，C线为阳性对照，C线含有用于试纸条质量控制的蛋白或抗体，如生物素标记的牛血清白蛋白或卵清蛋白（标记物垫上含链亲和素），或者羊抗兔抗体（标记物垫上含兔抗体）。

用免疫层析技术检测样品中真菌毒素的方法，如图1示，当样品溶液滴加到试纸条的样品垫1上后，液体将沿水平箭头方向移动，先到达标记物垫2，样品中的真菌毒素将与标记物垫2中荧光微球标记的真菌毒素抗原、荧光微球标记的兔抗一起向前移动，当溶液移动到达捕获膜的T线时，溶液中的真菌毒素、‘真菌毒素抗原～荧光微球’将一起竞争与固定在T线上的真菌毒素抗体结合。如果样品中的真菌毒素浓度高，则主要是样品中的真菌毒素与T线上的真菌毒素抗体结合，形成‘真菌毒素-真菌毒素检测抗体’复合物，而标记物垫上释放的‘真菌毒素抗原～荧光微球’则捕获较少，T线位置荧光信号较弱；如果样品中的真菌毒素浓度较低，则样品中的真菌毒素与T线上的真菌毒素检测抗体结合较少，而T线上的真菌毒素抗体捕获的‘真菌毒素抗原～荧光微球’较多，形成了较多的‘真菌毒素抗体-真菌毒素抗原～荧光微球’复合物，T线位置荧光信号较强。而标记物垫释放的兔IgG~荧光微球则继续移动，可被C线处能结合兔IgG的羊抗兔二抗结合。随后用检测仪来检测T线上的荧光信号，并与荧光信号-真菌毒素浓度标准曲线比较计算出待测样品中真菌毒素的浓度。

由于T线处真菌毒素抗体捕获的荧光微球包含有很多荧光分子，所以T线处可以检测到很强的荧光信号，从而使这种免疫层析技术检测真菌毒素的方法有很高的灵敏度。当荧光分子是时间分辨荧光复合物时，由于发射光有数百微秒到数毫秒的荧光寿命，可以在激发光撤掉后数十微秒到数百微秒检测发射光信号，此时激发光和背景荧光都已经消失，只有荧光分子特异的荧光信号，所以检测的特异性和灵敏度都大大提高。

本发明中的‘真菌毒素’指真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、玉米赤霉烯酮、单端孢霉烯族镰刀菌毒素（T-2毒素）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）、赭曲霉毒素A、伏马毒素、展青霉素、玉米赤霉醇等。

本发明中的‘微球’可以是二氧化硅微球、聚苯乙烯微球或其他高分子微球，微球直径在10nm到10μm之间，其表面可带有羧基、氨基或酮基等官能团。

本发明中的‘荧光微球’指球体中包埋了荧光分子的微球。所述‘荧光分子’包括荧光素、罗丹明等荧光分子或其衍生物、铕复合物、钐复合物、铽复合物等镧系元素复合物荧光分子以及铂复合物、钯复合物等磷光分子，其中铕复合物为铕与配体螯合后再与其他有机分子形成的复合物，铂复合物为铂与配体（包括卟啉、卟吩、吡啶及其衍生物）螯合形成的复合物，其中铕复合物又为时间分辨荧光复合物，铂复合物又为磷光复合物。

本发明中的‘荧光微球标记的真菌毒素抗原’指跟荧光微球耦联的真菌毒素抗原。该真菌毒素抗原为真菌毒素与蛋白的耦合物，该蛋白可以是BSA、卵清蛋白或其他蛋白。

本发明中的‘真菌毒素抗体’指结合在试纸条捕获膜上的真菌毒素抗体。更具体的，真菌毒素抗体为用跟牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白或其他蛋白耦联的真菌毒素免疫动物后动物血液中出现的能跟真菌毒素特异性结合的抗体。

本发明中试纸条捕获膜上的‘T线’指真菌毒素抗体所在的区域，也就是荧光微球标记的真菌毒素抗原与真菌毒素抗体结合的区域。

本发明中试纸条捕获膜上的‘C线’指荧光微球标记的兔IgG与羊抗兔二抗结合的区域，或者其他作为试纸条质量控制的抗体或抗原所在的区域。

因为真菌毒素毒性很大，所以饲料或食品中即使含少量的真菌毒素，也会对身体产生伤害。而本发明可以通过免疫层析法方便、简单、快速并且高灵敏度地检测样品中的真菌毒素，避免含真菌毒素的饲料或食品被人或动物食用而对身体产生伤害。

附图说明

根据一个或多个不同的实施方式，参考下列附图对本发明进行了详细描述。附图仅为示例目的而提供，并且仅描述本发明典型或示例性的实施方式。这些附图被提供以促进读者对本发明的理解，将不被认为限制本发明的宽度、范围或应用性。

图1是本发明中荧光免疫层析检测真菌毒素的试纸条示意图。图1中，附图标记1-7说明：1-样品垫；2-标记物垫；3-捕获膜；4-吸水垫；5-支撑底板；6-C线；7-T线。

图2是实施例中用荧光免疫层析法所得荧光强度与真菌毒素浓度的关系曲线。

具体实施方式

实施例1，用荧光免疫层析检测样品中黄曲霉毒素M1的试纸条的制备

图1所示的用免疫层析检测黄曲霉毒素M1的试纸条准备方法如下：

1，羧基修饰的含铕复合物的SiO₂微球由长春志昂生物科技有限公司提供，黄曲霉毒素M1抗体以及黄曲霉毒素M1抗原由北京为康惠华生物技术有限公司提供。

2，荧光微球与黄曲霉毒素M1抗原、兔IgG的耦联

将200μl 20mM PBS, pH7.4，固含量1%的荧光微球与6毫克碳化二亚胺混合，室温振荡30分钟，12,000rpm离心10分钟，用硼酸盐缓冲液清洗2次，将活化的荧光微球重悬于300μl硼酸盐缓冲液中。在微球悬液中加入200μl 1mg/ml的黄曲霉毒素M1抗原，在室温下振荡反应2.5小时。将反应后的溶液于12,000rpm离心10分钟，加入400μl 0.25M乙醇胺在室温再振荡30分钟。将反应后的溶液离心后再用PBS缓冲液洗2次。离心沉淀后加入300μl 2mg/ml的BSA重悬，常温振荡30分钟后用PBS洗3次，再用200μl 50mM PBS, pH7.4, 0.1% Tween 20, 5%蔗糖重悬荧光微球标记的黄曲霉毒素M1抗原。

兔IgG与荧光微球的藕联同上方法。

3，荧光微球标记的黄曲霉毒素M1抗原、荧光微球标记的兔IgG处理标记物垫，黄曲霉毒素M1抗体以及羊抗兔抗体（美国Sigma公司）处理捕获膜

将荧光微球标记的黄曲霉毒素M1抗原溶液与荧光微球标记的兔IgG溶液等体积混合，再用BioDot喷膜仪喷到标记物垫（Millipore公司）上，喷速为9μl/cm。将1mg/ml黄曲霉毒素M1抗体以及1mg/ml羊抗兔抗体用BioDot公司喷膜仪划线捕获膜（Millipore公司NC膜），划线速度为2μl/cm。然后将喷好的标记物垫和捕获膜置于37°C恒温箱中干燥1小时，再将标记物垫上含有荧光微球标记的黄曲霉毒素M1抗原的部分切割下来，得到5mm宽，30cm长的条带。

4，试纸条大卡的组装与切割

按照图1中试纸条的结构所示，将捕获膜首先粘贴在支撑底板（Millipore公司）上，在靠T线一侧先后粘贴标记物垫以及样品垫（Millipore公司），在靠C线一侧粘贴吸水垫（Millipore公司），然后用BioDot公司切割机切割成5mm宽的试纸条，于铝箔袋中封闭保存备用。

实施例2，用荧光免疫层析法检测样品中的黄曲霉毒素M1

将100μl 含0μg/L, 0.05μg/L, 0.1μg/L, 0.5μg/L, 1μg/L, 5μg/L, 10μg/L, 50μg/L的黄曲霉毒素M1溶液分别滴加到免疫层析试纸条上，反应15分钟后用荧光检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测荧光信号，然后用荧光强度相对黄曲霉毒素M1浓度作图得荧光强度对黄曲霉毒素M1浓度的标准曲线如图2。

将100μl含黄曲霉毒素M1的牛奶滴加到免疫层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后检测荧光信号，将荧光强度结合标准曲线计算得黄曲霉毒素M1浓度为0.45μg/L，与用ELISA法检测的结果一致，说明免疫层析定量检测黄曲霉毒素M1的方法是可靠的。

实施例3，用荧光免疫层析法检测样品中的玉米赤霉烯酮

检测玉米赤霉烯酮的试纸条制备方法同实施例1，其中的黄曲霉毒素抗原更换为玉米赤霉烯酮抗原，黄曲霉毒素抗体更换为玉米赤霉烯酮抗体，玉米赤霉烯酮的抗原和抗体也由北京为康惠华生物技术有限公司提供。

将100μl 含0μg/L, 0.05μg/L, 0.1μg/L, 0.5μg/L, 1μg/L, 5μg/L, 10μg/L, 50μg/L的玉米赤霉烯酮溶液分别滴加到免疫层析试纸条上，反应15分钟后用检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测荧光信号，然后用荧光强度相对玉米赤霉烯酮浓度作图得荧光强度对玉米赤霉烯酮浓度的标准曲线。

取100μl含玉米赤霉烯酮的样品溶液滴加到免疫层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后检测荧光信号，将荧光强度结合标准曲线计算得玉米赤霉烯酮浓度为0.4μg/L，与用ELISA法检测的结果一致，说明免疫层析定量检测玉米赤霉烯酮的方法是可靠的。

虽然本申请详细描述了具体的实施例，但本申请不限于这些实施例，相反，其意图涵盖包括在实施例的精神和范围内的各种修改和等同方案，在一些具体情况下，可以缺少和增加某个或某些技术特征而不脱离本发明的精神和范围，本申请的范围仅由权利要求书限定。