一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生检测方法与流程

本发明涉及一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生检测方法，属于生物传感器领域，用于快速灵敏准确检测食品或水源样品中的农药阿特拉津残留，具有大型仪器无法比拟的优点。

背景技术：

除草剂阿特拉津(Atrazine，ATR)又名莠去津，全称为2-氯-4-乙胺-6-异丙胺-1，3，5-三嗪，分子量为215.69三嗪类除草剂作为选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，通过抑制光合作用达到去除杂草的目的，自上世纪50年代开发生产以来得到了大面积使用，主要用于玉米、高粱、甘蔗、果树、林地等旱田，其中以阿特拉津(ATR)使用最为广泛；ATR具有一定残留毒性，可抑制水体中多种藻类的光合作用，使鱼的生理功能发生紊乱、杀死水底节肢动物，严重时可致使小鼠的染色体受损。在低浓度长期暴露下，ATR会使人体的内分泌系统及生殖系统紊乱，具有潜在的致癌作用。鉴于此，许多国家对水体中ATR残留限量做出了明确规定：美国环境保护局规定ATR在水中的最高允许浓度为3μg/L，欧盟规定饮用水中ATR含量不得超过0.1μg/L，我国国家环保部规定地表水(1-2类)中ATR的最高允许浓度为3μg/L。ATR残留引起的环境污染及健康危害问题已引起人们的广泛关注。因此，在实践工作中迫切需要建立ATR残留的快速检测方法。

对ATR实现准确分析的常用方法有GC-MS、HPLC-MS以及传感器检测等。这些检测方法主要是通过对样品的光、电学信号的改变来实现检测，因而对样品前处理要求高，程序繁琐，消耗时间长，并且仪器设备昂贵、需要专业的操作人员，极大的限制了快速检测方法的建立。免疫学检测方法具有方法快速、简便、灵敏高、特异性强、设备便携等优点使其适合于快速检测，在检测基质成分单一的样品时具有良好的效果，但面对复杂基质样品时，检测信号常受到基质光学特性严重干扰，另外，农药残留物浓缩富集过程中应用的有机溶剂会使抗体的活性下降甚至丧失，会干扰后续抗原抗体的免疫反应，极大限制了免疫学方法快速检测小分子残留的应用。

量热传感器是对生物反应中伴随的吸热或产热信号进行检测。其共性之一就是通过固定化酶对特异性底物的催化反应中热焓的变化而实现检测。该检测技术具有良好的通用性及检测稳定性。与其它分析方法相比较具有诸多优势，如：可对大多数生物样品进行分析、固定化酶可重复使用、检测不受样品光、电学环境特性的干扰，可实现连续流动相下检测、检测过程简便、可引入参比部件等。由于热量传感元件无需与流动相直接接触，因而消除了传感器漂移现象。量热传感器最先用于对葡萄糖及尿素的检测，然后逐渐应用于临床医学、环境监测、食品卫生、工业过程监测等领域。由于检测热信号反应总的放热量，因而检测缺乏特异性是该类检测方法的不足。对于由载液与样品在pH及离子强度上的不匹配造成的非特异性信号响应可以通过对样品稀释或引入参比柱进行信号差异性检测加以克服。量热检测方法中热信号以峰的形 式出现，峰高正比于放热量，峰面积及峰上升斜率与底物浓度呈线性关系。量热生物检测(TELISA)是基于酶联免疫吸附检测基本原理结合量热仪检测热信号的方法。Scheper等人利用夹心法建立了一种简单的TELISA方法用以检测各种IgG。

分子印迹材料含有大量印迹孔穴的分子印迹聚合物(MIP_s)是人工合成受体，它具有类似天然抗体或酶的特异性和选择性，这种含有合成识别元件的仿生传感器可以在各种恶劣的环境中使用。MIP_s包含大量的印迹孔穴，这些孔穴能够通过形状、大小和官能团(如氢键)与靶分子进行互补，它特别适用于小分子的检测。

技术实现要素：

本发明的第一个目的提供一种量热传感器反应柱其特征是固相载体所填充的表面印迹材料为农药阿

特拉津分子印迹聚合物。

本发明的第二个目的提供一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生检测方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明将分子印迹技术与量热传感检测技术相结合实现典型农药阿特拉津残留的量热仿生检测

1、通过表面印迹技术(s-MIT)在氨基化修饰的可控有孔玻璃珠(CPG)表面印迹针对阿特拉津的特异性印迹层，产物(s-MIP)作为量热仿生检测器反应柱填料；

2、将s-MIP作为识别元件及热信号响应元件。待测样品经简单前处理后上样，直接检测待测物与印迹位点结合过程释放的热信号。实现仿生量热传感方法定量检测典型农药阿特拉津。

本发明的有益效果：本发明样品前处理简便、无需标记、“一步法”快速、特异，克服了大型仪器检测样品前处理复杂的缺点。本发明检测灵敏度为ppm级，方法线性范围：3.9-120μg/mL，检测限：1.1μg/mL。加标回收实验及方法学比对结果说明与HPLC法检测阿特拉津具有良好的一致性。为定量检测典型农药阿特拉津残留提供了一种快速、可靠、灵敏的检测方法。

附图说明

图1图I s-MIP SEM表征图(左图为未印迹的CPG裸球，右图为印迹后产物)

图2MIP量热检测装置及检测原理示意图

图3ATR-MIP/CPG(SSS，pH 3.8)流速优化

图4MIP量热法检测ATR标准曲线

图5MIP量热法选择性

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可从常规试剂公司购买得到。

本发明的技术方案：一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生检测方法：

1.s-MIP的制备

(1)将2.85g阿特拉津溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)乙酸缓冲液混合溶液(DMF：乙酸缓冲液＝9∶1，v/v；乙酸缓冲液，0.2mol/L，pH3.8)。在机械搅拌的条件下使其完全溶解；

(2)依次将13.63g对-苯乙烯磺酸钠(SSS)、1.46g亚甲基双丙烯酰胺(BIS)及400mg可控有空玻璃珠(CPG)加入步骤(1)的混合溶液中，形成印迹预聚合体系；

(3)38℃水浴，搅拌子转速300rpm条件下体系预聚合12h；

(4)预聚合体系通入氮气30min，加入过硫酸铵(APS)引发接枝印迹聚合，反应10h；

(5)经砂芯漏斗通过真空抽滤将印迹产物从体系分离；

(6)用50％甲醇水溶液，pH 8～9，含1mol/LNaCl的再生液37℃条件下对产物再生24h，期间每8h更新再生液1次。制备得到的产物用乙醇冲洗后在真空干燥箱烘干备用。同时对所得产物进行扫描电镜表征(SEM)鉴定，结果如图1所示。从SEM表征图可见，CPG表面形成明显的印迹层。

方法中功能单体对-苯乙烯磺酸钠(SSS)与交联剂亚甲基双丙烯酰胺(BIS)摩尔比为7∶1；功能单体对-苯乙烯磺酸钠(SSS)与模板分子阿特拉津(ATR)摩尔比为5∶1

2.MIP量热法检测阿特拉津：MIP量热检测装置如图2所示：

(1)将表面印迹产物装入反应器置于热调节器中，通入经0.22μm针式滤器过滤及超声除气的载液(0.02molL-1，pH3.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，含2％DMF)平衡流动体系，体系流速800μl min-1；

(2)用载液为溶剂配制0-120μg mL-1梯度浓度的阿特拉津溶液。

(3)加入样品溶液，待测物与印迹孔穴结合及解离过程伴随的热信号变化被惠斯通电桥收集、转化后在量热工作站(N2000色谱数据工作站)上以峰信号显示；

(4)单个样品检测耗时约5min，无需再生可连续检测。

3.条件优化与选择

(1)本实验中选用表面印迹材料作为固相载体及识别元件：1、在量热方法中最常用到的孔性固相载体CPG表面进行印迹利于控制印迹产物的粒径及孔径控制，使印迹产物在流动相下不产生太高的背景压力；2、CPG微球上进行表面印迹可以确保印迹材料的机械稳定性，提高印迹产物耐受流动相对结构的干扰的能力；3、孔性微球上表面印迹材料的制备利于质量传递，利于印迹孔穴与目标分子的迅速识别，利于量热方法的建立；

(2)体系流速对信号响应强度有明显影响，综合考虑信号强度与稳定性，选定800μl/min为检测体系流速(如图3所示)。

4.标准曲线的获取：

在优化条件的基础上，将测得的信号值整理并绘制检测方法标准曲线，如图4所示。方法线性范围：3.9-120μg/mL，检测限：1.1μg/mL。；

5.方法特异性实验：

选用与ATR结构类似的西玛津(Simazine，SIM)、三聚氰胺、间苯三酚测定方法的特异性，结果如图5所示，印迹孔穴的选择性如下：阿特拉津＞西玛津＞三聚氰胺＞三间苯三酚，除对结构高度类似的三嗪类除草剂交叉反应性最为明显(87.5％)。可以通过印迹配方及检测体系的进一步优化进一步提高方法的检测特异性。

6.方法学比对实验

由于本方法检测灵敏度为ppm级，因而选定用HPLC进行方法学比对。实验结果见表1。

表1.自来水中ATR加标回收实验及方法学比对结果(Mean±SD，n＝3)；

1均数；2标准差

由表1中可知，基于s-MIP与量热传感检测技术相结合建立的新型MIP量热检测方法与大型仪器方法具有较好的可比性。同时由于该方法识别元件与产热元件制备原理具有一定的通用性，且方法可以实现对样品中目标物的无标记直接检测，非常适宜于在实践中推广。该方法可以作为检测农药残留的样品前处理简便、高特异性、快速检测方法。具有良好的应用前景。

实施例1

(1)将表面印迹产物(按照步骤1方法制备)装入反应器置于热调节器中，通入经0.22μm针式滤器过滤及超声除气的载液(0.02mol L-1，pH3.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，含2％DMF)平衡流动体系，体系流速800μl min-1；

(2)用载液为溶剂配制0-120μg mL-1梯度浓度的阿特拉津溶液。

(3)加入样品溶液，待测物与印迹孔穴结合及解离过程伴随的热信号变化被惠斯通电桥收集、转化后在量热工作站(N2000色谱数据工作站)上以峰信号显示；单个样品检测耗时约5min，无需再生可连续检测。