本发明涉及兽药残留检测技术领域，特别是检测大米中敌敌畏的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
敌敌畏为广谱性杀虫、杀螨剂，用来防治棉蚜等农业害虫，也用来杀死蚊，蝇等。具有触杀、胃毒和熏蒸作用。触杀作用比敌百虫效果好，对害虫击倒力强而快。纯品为无色至琥珀色液体，微带芳香味。制剂为浅黄色至黄棕色油状液体，在水溶液中缓慢分解，遇碱分解加快，对热稳定，对铁有腐蚀性。对人畜中毒，对鱼类毒性较高，对蜜蜂剧毒。因此定期对敌敌畏残留进行检测成为许多国家的监控的必要手段。
酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测敌敌畏的酶联免疫试剂盒及其检测方法。
技术实现要素：
为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测敌敌畏的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。
本发明检测敌敌畏的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、敌敌畏标准品、敌敌畏抗体工作液、敌敌畏酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
本发明检测敌敌畏的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、敌敌畏标准品的制备、敌敌畏抗体工作液的制备、敌敌畏酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。
其进一步特征在于：所述的酶标板经由敌敌畏抗原包被制备，具体步骤是将敌敌畏半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将敌敌畏包被抗原稀释成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。
敌敌畏标准品浓度分别为0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
所述敌敌畏抗体工作液是采用敌敌畏人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。
所述敌敌畏酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2 mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1 mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5% 吐温-20，0.1 mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
检测敌敌畏的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法包括以下步骤：
(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液中；
(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(3)取包被有敌敌畏抗原的酶标板，加标准品/样本50 μL/孔到对应的微孔中，加入敌敌畏酶标二抗工作液，50 μL/孔，然后加入敌敌畏抗体工作液，50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；
(4)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260 μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；
(5)加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20 min；
(6)加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值（请在5 min内读完数据）；
(7)以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中敌敌畏的含量。
本发明检测敌敌畏的酶联免疫试剂盒及其检测方法的测定原理：样品中的敌敌畏与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中敌敌畏的含量。如果样品中的敌敌畏含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的快速检测。
具体实施方式
敌敌畏蛋白质偶联物的制备：
采用琥珀酸酐法得到带羧基的敌敌畏半抗原衍生物，之后取0.05 mmol与载体蛋白BSA按10：1的结合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，然后加入0.15 mmol碳二亚胺，搅拌置室温反应24 h，最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS缓冲液中透析两天，除去未反应的半抗原，将得到的蛋白质偶联物溶液于-20℃保存备用。
敌敌畏抗体的制备：
选用健康成年纯种BALA/C小鼠，取与蛋白质偶联制备的免疫抗原50μg与等量完全弗氏佐剂混合采用腹腔注射进行初次免疫，之后每隔3周用相同剂量免疫抗原加等量不完全弗氏佐剂采用腹腔注射进行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾静脉采血测定抗血清效价至一定滴度后，用相同剂量不加佐剂进行末次免疫，3天后取脾制备脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出所需要的杂交瘤细胞系进行克隆化，选择处于对数生长期的杂交瘤细胞进行冻存，用于腹水制备，先腹腔注射0.5 ml液体石蜡于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7-10天后可产生腹水，待腹水尽可能多时用注射器抽取腹水，反复收集数次，4000 rpm离心15 min，收集上清，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水对单克隆抗体进行纯化，冷冻干燥得冻干粉后于-20 ℃保存备用。
制备包被有敌敌畏包被抗原的酶标板：
包被抗原是将敌敌畏半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将敌敌畏抗原稀释成1:40000比例，100 µL/孔，37℃放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 µL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150 µL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。
敌敌畏标准品配制浓度分别为0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
敌敌畏抗体工作液的制备：采用敌敌畏人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。
敌敌畏酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为2 mol/L的硫酸，浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1 mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5% 吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
基于上述制备的试剂，本发明用于检测敌敌畏的酶联免疫试剂盒包括如下材料：
(1)96孔酶标板×1块；
(2)标准液×6瓶：(1mL/瓶) 0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg；
(3)抗体工作液 7 mL；
(4)酶标二抗工作液 7 mL；
(5)底物液A 7 mL；
(6)底物液B 7 mL；
(7)终止液 7 mL；
(8)10×浓缩稀释液 40 mL；
(9)10×浓缩洗涤液 40 mL；
本发明的试剂盒用于检测农作物样本中敌敌畏残留量时，通过以下步骤实施：样品预处理、用本发明试剂盒进行检测、分析结果。
(1)用本发明试剂盒检测待测样品中敌敌畏残留量
取包被有敌敌畏抗原的酶标板，加标准品/样本50 µL/孔到对应的微孔中；加入酶标二抗工作液，50 µL/孔，然后加入敌敌畏抗体工作液，50 µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300 µL/孔，充分洗涤4次，浸泡15-30 s，用吸水纸拍干；加入底物液A 50 µL/孔，底物液B 50 µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15 min；加入终止液50 µL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值（请在5 min内读完数据）；对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中敌敌畏残留量。
(2)分析结果
百分吸光度值的计算，标准品或样本的百分吸光度值等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值(%) ＝B/B0×100%
其中B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0—0 ppb标准溶液的平均吸光度值。
以敌敌畏的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中敌敌畏的实际浓度。