玛咔芥子油苷分光光度计定量方法与流程

本发明涉及一种玛咔芥子油苷分光光度计定量方法。

背景技术：

芥子油苷也简称为硫苷，虽已有多篇报道阐明芥子油苷(如苄基芥子油苷、间甲氧基苄基芥子油苷)及其降解产物异硫氰酸酯类(如烯丙基异硫氰酸酯、苯基异硫氰酸酯)具有一定的抗癌活性，并且新鲜玛咔约含有1％的芥子油苷，是其他如西兰花等十字花科植物所含的芥子油苷含量的100倍左右。但当玛咔组织细胞受到破坏时，芥子油苷就会与植物内源的硫苷酶相遇而发生水解，因此如何准确定量分析玛咔中的芥子油苷的含量显得尤为重要。

虽有报道采用酶解芥子油苷法，利用检测的葡萄糖含量来推测总芥子油苷含量；也有通过硫酸酯酶对芥子油苷脱硫酸根等样品前处理操作，再利用HPLC检测多种芥子油苷的含量。但第一种方法存在不能保证酶解是否完全以及很难排除自身葡萄糖的干扰的问题，而第二种方法中的脱硫酸根操作繁琐复杂不宜于技术的推广。而如果通过研究降解物的成分及其含量来推测芥子油苷的含量，则须考虑如何保证降解的完全度及降解物的稳定性。因此进行以芥子油苷为检测对象的定量方法的研究，则较为适宜。

技术实现要素：

本发明提供了一种玛咔芥子油苷分光光度计定量方法。

本发明采用如下技术方案：

一种玛咔芥子油苷分光光度计定量方法，包括以下步骤：

(1)取样品称定，之后加入乙醇于水浴条件下回流提取，减压抽滤并测之体积；

(2)移取样品溶液，并依次向其中加入CMC-Na溶液、PbCl₂显色溶液，每加入一次试剂均摇匀后再加，摇匀后放置；

(3)在分光光度计检测波长272nm处检测各样品吸光度知，并以提取溶剂、PbCl₂-CMC-Na为空白作对照。

优选的，所述步骤(1)中乙醇的加入量为样品质量的25倍，乙醇的体积分数为75％。

优选的，所述步骤(1)中水浴温度为75℃，回流提取时间为2.5小时。

优选的，所述步骤(2)中CMC-Na溶液的质量分数为0.15％，PbCl₂显色溶液浓度为0.8m mol/L，放置温度为19～25℃，放置时间2小时。

优选的，所述步骤(3)中空白为0.8m mol/L PbCl₂-0.15％CMC-Na。

本发明提供的玛咔芥子油苷分光光度计定量方法通过对最佳检测波长的选择、不同浓度的乙醇的影响、不同提取方法的影响、CMC-Na的影响等条件的系统研究，以期确立简单可靠专属性强的、适合玛咔中芥子油苷含量测定的方法，为今后的研究奠定基础。

附图说明

图1是本发明PbCl₂显色剂的波长扫描(800-200nm)结果；

图2是本发明九个不同浓度的标准品溶液波长扫描(800-200nm)结果；

图3是本发明样品溶液波长扫描(800-200nm)结果；

图4是本发明标准品波长扫描(800-200nm)结果；

图5是本发明标准品溶液波长扫描(800-200nm)结果；

图6是本发明标准品在272nm处的标准曲线；

图7是本发明稳定性试验结果。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

一种玛咔芥子油苷分光光度计定量方法，包括以下步骤：

(1)取样品称定，之后加入乙醇于水浴条件下回流提取，减压抽滤并测之体积；

(2)移取样品溶液，并依次向其中加入CMC-Na溶液、PbCl₂显色溶液，每加入一次试剂均摇匀后再加，摇匀后放置；

(3)在分光光度计检测波长272nm处检测各样品吸光度知，并以提取溶剂、PbCl₂-CMC-Na为空白作对照。

最佳检测波长的选择

全波长扫描试验

1)空白参照溶液的全波长扫描试验

以水为空白，按照3.2项下显色方法显色后在UV 2600分光光度计上进行波长扫描(800-200nm)以扣除背景。

2)0.8m mol/L PbCl₂显色剂的全波长扫描试验

取1mL0.8m mol/L PbCl₂显色剂于比色皿中，以空白参照溶液为对照，按照相关操作，在UV 2600分光光度计上进行波长扫描(800-200nm)，以检测0.8m mol/L PbCl₂显色剂本身对试验是否有影响。

3)标准品溶液的全波长扫描试验

取黑芥子硫苷酸钾水合物适量，精密称定置10ml棕色量瓶中，加甲醇(HPLC级)溶解并定容至刻度，摇匀，制得0.389mg/mL的SH-标准品母液；分别精密移取0.389mg/mL的SH-标准品母液0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.70mL、0.80mL、1.00mL置20mL具塞试管中，之后，依次精密移加水1.90mL、1.80mL、1.70mL、1.60mL、1.50mL、1.40mL、1.30mL、1.20mL、 1.00mL，摇匀，使之均为2.00mL，之后按照3.2项下显色方法显色，平行做两份样品；并以2.00mL水为空白制得空白参比溶液；

分别取参比溶液及对各个对照品溶液，在UV 2600分光光度计上进行波长扫描(800-200nm)以检验并确定最佳检测波长。

4)样品溶液的全波长扫描试验

取样品溶液按显色反应显色，并且每份样品均平行做两份；并以2.00mL提取溶剂为空白，制得空白参比溶液；分别取参比溶液及样品溶液，在UV 2600分光光度计上进行波长扫描(800-200nm)以检验并确定最佳检测波长。

在272nm与540nm处的检测

将标准品溶液、样品溶液显色后，在UV 2600分光光度计272nm、540nm处分别检测各吸光度值。

不同浓度的乙醇的影响

鉴于今后试验将涉及不同浓度的乙醇，故有必要考察不同浓度的乙醇作为空白参照时对试验的影响。本试验以水为空白参照，考察了95％乙醇、70％乙醇、45％乙醇分别显色后的紫外吸收情况，在最佳检测波长处检测比较各个样品。

不同提取方法的影响

乙醇回流提取法

称取Maca药粉适量，精密称定，加入25倍量70％乙醇于75℃水浴中回流提取2.5h，减压抽滤，合并滤液，即得乙醇回流提取样品溶液；

水煎煮法

称取Maca药粉适量，精密称定，分别加入10倍量水于电热套中加热，进行回流提取5h后，趁热减压抽滤，即得水煎煮样品溶液； 向药渣中加入10倍量80％乙醇冷浸(室温)一周后，减压抽滤，滤液于-0.1MPa、39.9℃条件下减压浓缩至无醇味，即得冷浸样品溶液。常压蒸馏法

称取Maca药粉适量，精密称定，加入10倍量水进行常压蒸馏，收集瓶置于冰块附近，蒸馏6h；将接收的馏分用乙酸乙酯(AR级)萃取后，于-0.1MPa、39.9℃条件下减压回收残留的乙酸乙酯，即得常压蒸馏馏分水层样品溶液。

0.15％CMC-Na的影响

虽然文献报道，在分光光度法测定油菜籽中硫代葡萄糖甙过程中，羧甲基纤维素钠不参与显色反应，只作为分散介质，但在检测玛咔中的硫代葡萄糖甙芥子油苷时，是否也需要CMC-Na作为分散介质，本试验进行了考察。

0.15％CMC-Na对标准品溶液的影响

精密移取800μL 0.192mg/mL黑芥子硫苷酸钾水合物，并精密移加水1.20mL补足至2mL于20mL具塞试管中，按3.2项下显色反应显色；同时，以同等体积的水代替0.15％CMC-Na平行制备对照品溶液两份；并以水为空白，平行制备加0.15％CMC-Na以及不加0.15％CMC-Na的空白参比溶液各两份；之后进行波长扫描(800-200nm)。

0.15％CMC-Na对样品溶液的影响

按照确定的提取方法提取玛咔，其中提取溶剂包括：95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、65％乙醇、55％乙醇、45％乙醇、35％乙醇、25％乙醇、70％甲醇；

各个提取液按照3.2项下显色方法显色；并以等体积的水代替 0.15％CMC-Na平行制备样品溶液两份；并以各自溶剂为空白，平行制备加与不加0.15％CMC-Na的空白参比溶液各两份；之后在最佳检测波长处检测各吸光度值A，以确定0.15％CMC-Na对样品溶液吸光度值的影响。

标准曲线的制作

标准品溶液的制备

取黑芥子硫苷酸钾水合物适量，精密称定置10mL棕色量瓶中，加水(PH＝6.22)溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.389mg/mL的SH-标准品母液；

分别精密移取0.389mg/mL的SH-标准品母液0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL置20mL具塞试管中，之后，依次精密移加水1.90mL、1.80mL、1.70mL、1.60mL、1.50mL、1.40mL，摇匀，使之均为2.00mL；依次显色并依照Std-1至Std-6的顺序依次标记，均平行做两份；并以2.00mL水为空白制得空白参比溶液；

最佳检测波长的验证

分别取参比溶液及各个对照品溶液进行波长扫描(800-200nm)，以检验并确定最佳检测波长；

标准曲线的绘制

在最佳检测波长处检测Std-1至Std-6各个标准品吸光度值A，并以各溶液的浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标，进行回归分析；

精密度试验(日内与日间)

取Std-6、Std-4、Std-2标准品溶液，在最佳检测波长处分别每天连续检测6次、检测3天，进行日内精密度试验与日间精密度试验。

重复性试验

取同一批样品2.0g各三份，共取6份，精密称定，分别加入25倍量75％乙醇于75℃水浴条件下回流提取2.5h，均减压抽滤，测得体积；显色后于最佳检测波长处分别检测。

稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0min、30min、60min、90min、120min在最佳检测波长处分别检测其吸光度值。

加样回收率试验

精密称取已知含量的样品1.0g，共6份，分别加入对照品11.4mg，按照3.2.7重复性试验项下提取方法操作制得样品溶液；显色后，于最佳检测波长处分别检测各吸光度值后计算回收率。

含量测定

取不同批次的Maca粉2.0g各三份，共取6份，精密称定，按照3.2项下确定的提取方法操作制得样品溶液；显色后于最佳检测波长处分别检测其各自的吸光度值。

实验结果与讨论

最佳检测波长的选择

全波长扫描试验

1)空白参照溶液的全波长扫描试验

以水为空白参照溶液的全波长扫描试验结果表明在800-200nm 的波长扫描范围内，空白参照溶液无紫外吸收；

2)0.8m mol/L PbCl₂显色剂的全波长扫描试验

由图1可知，在800-200nm的波长扫描范围内，0.8m mol/LPbCl₂显色剂在298nm与418nm处有最大紫外吸收，显色剂本身对试验方法的最大紫外吸收波长540nm无影响。

3)标准品溶液的全波长扫描试验

由图2可知，九个不同浓度的标准品溶液在800-200nm的波长扫描范围内，均在272nm处有最大紫外吸收；

4)样品溶液的全波长扫描试验

由图3(左：样品1，右：样品2)可知，在800-200nm的波长范围内，样品溶液均在272nm处有最大紫外吸收；综上，在800-200nm的波长扫描范围内，不论是黑芥子硫苷酸钾水合物标准品溶液还是样品溶液，均在272nm处有最大紫外吸收。

在272nm与540nm处的检测

显色后的标准品溶液、样品溶液分别在272nm、540nm处检测的各吸光度值如表1所示；由此可知，在540nm处所测得的各个样品含量均远不如272nm处的结果高，故进一步验证272nm为最佳检测波长。

表1 272nm与540nm检测结果(n＝3)

不同浓度的乙醇的影响

表2 272nm检测样品结果

在最佳检测波长272nm处检测各显色后的乙醇溶剂的结果(如表2)表明，在波长272nm处，不同浓度的乙醇对吸光度值是有影响的，不同浓度的乙醇的紫外吸收情况是不同的，随着乙醇浓度的增加，其紫外吸光度值越大；并说明试验涉及到不同浓度的乙醇提取溶剂时须以各自溶剂做空白参比溶液。

不同提取方法的影响

表3不同提取方法所得样品在272nm处检测结果(n＝3)

在UV 2600分光光度计272nm处检测各个样品，由表3结果表明，不同的处理方法所得芥子油苷的含量亦不同，其中，乙醇回流提取法所得的样品中芥子油苷平均含量最高(达到1.25％)，水煎煮法次之，常压蒸馏法最差；由于芥子油苷具有遇热不稳定、遇水会降解的性质，为减免芥子油苷长时间处于高温状态，故确定选择乙醇回流法为样品的提取方法。

0.15％CMC-Na的影响

0.15％CMC-Na对标准品溶液的影响

由图4(左：无CMC-Na；右：有CMC-Na)可知，在800-200nm波长扫描范围，加不加0.15％CMC-Na标准品溶液检测结果均有一最大吸收波长272nm，但二者对比，很明显加0.15％CMC-Na时的图 谱较好，故对标准品溶液确定显色方法选用加0.15％CMC-Na的操作。

0.15％CMC-Na对样品溶液的影响

表4 272nm处样品的检测结果(n＝3)

采用不同浓度的乙醇(甲醇)为提取溶剂，并依据乙醇回流法制得样品后显色检测；由表4结果表明，虽然与在显色反应过程中加0.15％CMC-Na时相比，各个样品溶液的吸光度值在不加0.15％CMC-Na时较大，但就稳定性而言，试验过程中，不加0.15％CMC-Na的样品溶液20min左右就会有黑色颗粒状物析出，并对其检测发现其吸光度值骤降，故综合考虑方法须稳定准确可重复的因素，认为在显色反应时须加入0.15％CMC-Na作为分散介质。同时纵观表4试验结果知，采用70％甲醇作提取溶剂时获得的玛咔芥子油苷平均含量最高(1.5％左右)，但考虑到甲醇较乙醇对人体造成的毒性较大且不宜于后期的工艺技术路线的生产放大等问题，故选择乙醇作为提取溶剂；并由表4结果知在不同浓度的乙醇中尤以75％较佳。

综上可知，确定的供试品的提取方法为：取样品2.0g，精密称定，之后加入25倍量75％乙醇于75℃水浴条件下回流提取2.5h，减 压抽滤并测之体积。显色方法为：精密移取样品溶液2.00mL，并依次向其中加入4mL 0.15％CMC-Na溶液、2mL 0.8m mol/L的PbCl₂显色溶液，每加入一次试剂均摇匀后再加，摇匀后在22±3℃放置2h。检测方法为：在最佳检测波长272nm处检测各样品吸光度知，并以提取溶剂、0.8m mol/L PbCl₂-0.15％CMC-Na为空白作对照。

标准曲线的制作

最佳检测波长的确定

分别取参比溶液及各个对照品溶液进行波长扫描(800-200nm)，结果由图2-5知标准品Std-4、Std-5、Std-9的最佳检测波长均为272nm；进一步验证了最佳检测波长为272nm。

图5为标准品溶液波长扫描(800-200nm)结果(从左至右为标准品Std-4、Std-5、Std-9)

标准曲线的制作

在最佳检测波长272nm处检测Std-1至Std-6各个标准品吸光度值A，以各溶液的浓度(C)为横坐标、以吸光度值(A)为纵坐标，进行回归分析，得回归方程y＝0.0049x+0.0486(R²＝0.9995)，表明在19.45-116.70μg/ml范围内线性关系良好，如图6所示。

标准品的溶剂问题

本试验曾以甲醇作为标准品的溶剂，但反复多次试验，在272nm处所得的标准曲线的线性关系均不符合要求(R²<0.999)，推测：当甲醇作为溶解标准品的溶剂时，由于不同浓度的标准品溶液在显色反应前均以水补足至2.00mL，并且以2.00mL水作空白，当标准品加入的量多时(如0.80mL)甲醇的含量比例较多，故以水为空白扣除背景时会造成很大误差，致使多次试验的标准曲线的线性关系均不符 合要求(R²<0.999)，故改用水为溶解溶剂。

显色剂的用量问题

本试验曾考察了9个不同浓度的标准品溶液(浓度范围为19.45-175.05μg/mL)的线性关系，结果从Std-7至Std-9(即浓度范围为136.15-175.05μg/mL)无法与之前的6个标准品达到很好的线性关系(R²<0.998，即r<0.999)，并且Std-7至Std-9三者的检测结果明显趋于一定值；推测出现这种情况的原因为由于加入的显色剂的质量是一定的，在一定范围内，增加标准品的含量，所检测到的吸光度值A也呈一定的趋势增加；但当超出此范围后，由于所加显色剂是一定的，故过多的标准品将无法全部显色，进而导致检测的吸光度值A不呈现规律的增加趋势而是趋于某一值。另外，考虑到紫外分光光度法检测样品时，吸光度值的最佳范围为0.2-0.8，故确定以浓度19.45-116.70μg/ml为线性考察范围。

精密度试验(日内与日间)

表5日内与日间精密度结果

由表5结果表明，不论是日内精密度还是日间精密度，RSD值均小于3％，表明仪器精密度较好。

重复性试验

由表6结果可知芥子油苷平均含量为1.1486％，RSD＝2.87％，表明该方法重复性良好。

稳定性试验

结果RSD＝2.53％≤3％，表明供试品在30min内基本稳定，在显色后的30min内检测结果可信。

表6重复性试验结果(n＝3)

加样回收率试验

回收率＝(实测量－样品含量)/加入对照品量×100％

表7芥子油苷回收率试验结果(n＝3)

由表7结果可知芥子油苷平均回收率为99.55％，且结果稳定，回收率变化范围为95％-103％，RSD＝2.73％≤3％，表明该方法准确可靠。

含量测定

表8玛咔芥子油苷含量测定结果(n＝3)

由表8结果表明芥子油苷平均含量均约为1.10％，符合文献报道的玛咔中有1％左右的芥子油苷含量，并且RSD≤3％，表明确立的玛咔芥子油苷紫外分光光度计定量检测方法重复性良好，可供今后分析检测玛咔芥子油苷的含量。

本发明通过方法学考察，确立了玛咔芥子油苷紫外分光光度计定量检测的方法。其中，供试品的提取方法为：取样品，精密称定，之后加入25倍量75％乙醇于75℃水浴条件下回流提取2.5h，减压抽滤并测之体积。显色方法为：精密移取样品溶液2.00mL，并依次向其中加入4mL 0.15％CMC-Na溶液、2mL 0.8m mol/L的PbCl₂显色溶液，每加入一次试剂均摇匀后再加，摇匀后在22±3℃放置2h。检测方法为：在最佳检测波长272nm处检测各样品吸光度知，并以提取溶剂、0.8m mol/L PbCl₂-0.15％CMC-Na为空白作对照。玛咔芥子油苷的含量测定

采用本试验所建立的玛咔芥子油苷紫外分光光度计定量检测方 法，检测不同批次的玛咔，结果芥子油苷平均含量均约为1.10％，RSD≤3％，符合文献报道的玛咔中有1％左右的芥子油苷含量，表明确立的玛咔芥子油苷紫外分光光度计定量检测方法，准确可信重复性好，可供今后分析检测玛咔芥子油苷的含量。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。