一种测定样品中抗体浓度的方法与流程

免疫荧光是一种用于使用荧光显微镜的光学显微技术的技术，并且主要用于微生物样品。该技术利用抗体对其抗原的特异性，使荧光染料靶向细胞内的特定生物分子靶标，因此通过样品使靶标分子的分布可视化。免疫荧光是广泛使用的免疫染色的实例，并且是利用荧光团使抗体的位置可视的免疫组织化学的具体实例。CN103642261、WO2013153687、JP2012224646、US2012296098、WO2012149180、EP2312317、US20110143387、JP2010037511和US4937198描述了荧光探针及其用途的实例。

Nielsen等(Methods 22，71-76，2000)、WO9613722、WO2009078876、EP0957365、WO2010141249和US2006105397描述了荧光偏振免疫测定法，并且其可用于快速、准确地检测抗体或抗原。该测定法是基于溶液中小分子的旋转比大分子更快以及旋转率可通过荧光偏振确定的原则。当样品中的抗体与标记有荧光探针的抗体的特异性抗原一起孵育时，可以通过荧光偏振检测样品中抗体-抗原复合物的存在。该技术的问题是，为了检测给定的抗体，需要该抗体的特异性抗原，这使得该测定对许多公司来说是昂贵的。该技术的另一个问题是不适合用于定量检测样品中的抗体。

日本专利申请号2005-337805描述了一种使用荧光偏振测定抗体或抗原的方法，在一个实施方案中，使用重组通用(generic)抗体结合蛋白(蛋白A)和短寿命荧光染料(Alexa 647)的缀合物定量测定人IgG。该日本文献描述了使用浓度为1nM或10nM的荧光标记蛋白A，其分别相当于0.00005或0.0005mg/ml。预期该蛋白A与抗体按1:1的比例结合，并且由于它们的分子量分别为50,000Da和150,000Da，这意味着按1:3的重量比结合。从而1mg的蛋白A将结合3mg的抗体，因此将是“饱和的”，所述“饱和的”意味着抗体浓度的任何增加不应导致偏振值的增加，因为不会发生更多的结合。因此，1nM和10nM的蛋白A将具有在0.000015mg/ml和0.00015mg/ml抗体浓度的IgG浓度下饱和(即不增加任何更多的特异性结合)的FP信号。这显然不会出现在该日本专利的附图中。唯一明显的增加发生在该饱和极限之后，其中偏振的任何变化不是由于蛋白A与抗体的特异性结合，而是由于人为效应，例如随着抗体浓度增加粘度增加。因此，该文献中呈现的数据表明，在实践中该发明不起作用。

本发明的目的是克服上述问题中的至少一个。

技术实现要素：

本发明是基于如下发现：可以使用荧光偏振和示踪剂来测定样品中的准确和灵敏的抗体浓度或滴度，所述示踪剂包括与通用免疫球蛋白结合蛋白(如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L(以下称为“通用抗体结合蛋白”))缀合的长寿命荧光染料。这些蛋白质结合到所有免疫球蛋白G(IgG)分子的恒定区，并且因此可以用于测定任何IgG分子的浓度。图6显示了使用与短寿命染料相比的长寿命染料的影响。此外，本申请人已经出乎意料地发现，除去蛋白质的一部分(例如，除去了一个或多个抗体结合位点或非抗体结合位点)的截短通用抗体结合蛋白的使用提供了灵敏度的进一步提高。图7显示了使用与部分截短蛋白质(mw29KD)相比的高度截短IgG结合蛋白(mw7kD)的影响。

在第一方面中，本发明提供了一种测定液体样品中抗体滴度的方法，包括以下步骤：

将液体样品与抗体结合探针在反应室中一起孵育以提供反应混合物，所述抗体结合探针包括与荧光染料(通常为长寿命荧光染料)缀合的通用抗体结合蛋白；

测定反应室中的反应混合物的荧光偏振，以检测激发光和发射光之间的偏振变化；和

使偏振变化与所述样品的抗体滴度相关联。

在使用长寿命荧光染料的实施方案中，优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少4ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少5ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少6ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少7ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少8ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少9ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少10ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少15ns。优选地，所述长寿命荧光染料的荧光寿命为至少20ns。

优选地，所述荧光染料是FITC。优选地，所述荧光染料选自FITC和寿命为至少5ns的长寿命荧光探针。

优选地，所述通用抗体结合蛋白是蛋白A或蛋白。

优选地，所述通用抗体结合蛋白是截短通用抗体结合蛋白。

优选地，所述样品是细胞培养液。

优选地，所述细胞是真核的或原核的生产细胞。

优选地，所述反应室是多孔板的孔。

优选地，所述通用抗体结合蛋白(即通用IgG结合蛋白)的分子量不大于15kD以及所述荧光染料的寿命为至少5ns(理想地为至少10或15ns)。更优选地，所述通用抗体结合蛋白(即通用IgG结合蛋白)的分子量不大于10kD以及所述荧光染料的寿命为至少5ns(理想地为至少10或15ns)。理想地，所述通用抗体结合蛋白(即通用IgG结合蛋白)的分子量不大于5kD以及所述荧光染料的寿命为至少5ns(理想地为至少10或15ns)。

在第二方面中，本发明涉及测定多个细胞培养样本中抗体滴度的快速、高通量的方法，所述细胞培养样品包括抗体生产细胞(通常是IgG生产细胞，理想地是单克隆IgG生产细胞)，所述方法包括以下步骤：

将微量滴定板的单个孔中的每个细胞培养样品与抗体结合探针一起孵育以提供多个反应混合物，所述抗体结合探针包括与长寿命荧光染料缀合的通用抗体结合蛋白(即通用IgG结合蛋白)；

测定孔中的反应混合物的荧光偏振，以检测激发光和发射光之间的偏振变化；和

使偏振变化与所述细胞培养样品的抗体滴度相关联。

在一个实施方案中，所述多个细胞培养样品包括一组克隆生产细胞。因此，本发明还涉及测定一组克隆生产细胞中的抗体滴度的快速、高通量的方法。

通常，该方法使用能够同时在微量滴定板的多个孔上进行荧光偏振测定的荧光偏振分析仪。

本发明还提供了适于实施本发明方法的试剂盒，以及其包含(a)包含与荧光染料(优选长寿命荧光染料)缀合的通用抗体结合蛋白的抗体结合探针，和(b)荧光偏振分析仪。

优选地，所述通用抗体结合蛋白是截短的。

优选地，所述通用抗体结合蛋白是IgG结合蛋白。

优选地，所述IgG结合蛋白是蛋白G。

优选地，所述通用抗体结合蛋白包括分子量小于15kD或10kD的截短蛋白G。

优选地，所述荧光染料是FITC或其荧光寿命为至少5ns。

本发明还涉及一种荧光染料与通用抗体结合蛋白的缀合物。

在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白是截短的。

在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于30kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于25kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于20kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于15kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于10kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于8kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于5kD。

在一个实施方案中，所述荧光染料是长寿命荧光染料。在一个实施方案中，所述荧光染料的寿命为至少4ns。在一个实施方案中，所述荧光染料的寿命为至少5ns。在一个实施方案中，所述荧光染料是FITC或其寿命为至少4ns。

通常，该方法能够准确地测定抗体浓度的浓度范围为1-30mg/L，优选为1-40mg/L，并理想地为1-50mg/L。

附图说明

图1：在存在IgG的情况下，丹磺酰标记的蛋白A的荧光偏振影响。

图2：在存在IgG的情况下，FITC标记的蛋白G的荧光偏振影响。

图3：在存在稀释在CD-CHO培养基中的IgG的情况下，FITC标记的蛋白G的荧光偏振影响。

图4：在存在稀释在水中的IgG的情况下，FITC标记的蛋白G的荧光偏振影响。

图5：在存在稀释在水中的未标记的蛋白A的情况下，FITC标记的蛋白G的荧光偏振影响，。图6：在存在不同浓度的稀释在CD-CHO中的IgG的情况下，三种不同的示踪剂的荧光偏振影响。所述示踪剂是蛋白质G与(1)BIODOPY(寿命为5ns)、(2)FITC(寿命为4ns)和(3)Alexa647(寿命为1ns)偶联的缀合物。所述短寿命染料(Alexa 647)提供一个可以忽略不计的信号，而较长寿命染料提供很好的信号。

图7：在存在不同浓度的稀释在CD-CHO中的IgG的情况下，两种不同的示踪剂的荧光偏振影响。所述示踪剂是FITC(寿命为4ns)与(1)蛋白G(完整的G)和(2)截去两个IgG结合位点的截短蛋白G(gb1)偶联的缀合物。显然，使用包含高度截短的蛋白G的缀合物产生最大的信号。

图8：在存在不同浓度的稀释在CD-CHO中的IgG的情况下，不同示踪剂的荧光偏振影响。所述示踪剂是蛋白G与方酸菁轮烷染料偶联的缀合物，所述方酸菁轮烷染料在405nm下吸收并且寿命为约9ns。显然，使用更长寿命的染料提供了很好的信号。

具体实施方式

本发明涉及一种测定(优选定量测定)在液体样品(通常是细胞培养样品，以及理想地为包括单克隆抗体生产细胞的细胞培养样品)中抗体(通常是IgG抗体)的存在的方法。该方法使用荧光偏振分析来检测抗体(通常是IgG抗体)和通用抗体结合探针之间的结合。所述抗体结合探针包括通用抗体结合蛋白，例如与荧光探针(染料)(通常是长寿命荧光探针(染料)，如丹磺酰)缀合的通用IgG结合蛋白(如蛋白A、G、L、A/G)。由于所述探针包括通用IgG结合示踪剂，其能够用于任何IgG抗体的测定中，并且不针对任何特定的IgG抗体。在使用中，将所述样品与抗体结合探针一起孵育，分析通过所述样品或每个样品中的探针发射的光以检测荧光偏振，并且使检测的荧光偏振的水平与所述样品或每个样品中的抗体滴度相关联。

在本说明书中，术语“抗体”应理解为是指人源化或非人源化的免疫球蛋白，例如单克隆或多克隆形式的IgG，IgA，IgE或IgM免疫球蛋白或它们的片段。在一个实施方案中，所述抗体是IgG分子，优选单克隆IgG分子。在一个实施方案中，所述抗体是人抗体。

在本说明书中，术语“测定反应室中样品的荧光偏振”应理解为是指用与荧光染料的激发波长相对应波长的平面偏振光激发样品，并且在两个平面中检测由荧光染料以适当的发射波长发射的光强度，其中一个平面是平行于激发平面的平面，以及其中一个平面是垂直于激发光的平面。在一个实施方案中，所述激发平面是垂直或水平的，并且在垂直和水平平面中检测发射光。发射强度从激发平面(即垂直的)移动到垂直平面(即水平的)的程度(即激发光和发射光之间的偏振的变化)是荧光染料的旋转度的函数。当探针标记的抗体结合蛋白与抗体结合时，该复合物将比探针标记的抗体结合蛋白旋转得慢，导致发射光的偏振增加。

术语“使偏振的变化与抗体浓度相关联”应理解为是指基于由荧光探针发射的光的偏振的变化计算样品的抗体浓度。计算抗体浓度的方法包括从抗体的已知浓度的标准曲线推算抗体浓度，或通过计算解离常数和必要参数，并从第一性原理推算浓度。也可以使用竞争结合测定法来计算抗体浓度。

在本说明书中，术语“快速，高通量”应理解为是指该方法可以在1小时或更短时间内进行，优选小于30分钟。

本文所用的术语“抗体滴度”或“抗体浓度”是指在给定时间点存在于样品中的抗体的量，通常是重组抗体，理想地是重组单克隆抗体。通常，所述样品是细胞培养样品。优选地，所述样品是来自细胞培养样品的上清液。所述滴度或浓度可以以绝对术语或相对术语进行定量。通常，滴度或浓度是指单位体积培养物中产物的重量-克/升(g/L)是常用的度量。

本文所用的术语“样品”应理解为是指液体样品，例如细胞培养样品或源自细胞培养样品的上清液。优选地，所述细胞是生产细胞(即经基因改良以产生重组蛋白的细胞)，例如原核生产细胞(即大肠杆菌)或真核生产细胞(即CHO细胞)。原核生产细胞和真核生产细胞的实例都是本领域技术人员公知的。所述样品也可以是血液或血液衍生物，例如血浆或血清。优选地，在确定抗体浓度之前，从样品中除去细胞。

术语“通用抗体结合蛋白”应理解为是指结合到抗体(例如IgG、IgA、IgE或IgM抗体)恒定区的蛋白质、肽、多肽或非蛋白配体(如适配体)。在优选的实施方案中，所述通用抗体结合蛋白是通常对IgG抗体具有特异性的通用IgG结合蛋白，或IgG结合变体或其片段。通用IgG结合蛋白的实例包括蛋白A、蛋白G、蛋白A/G，和蛋白质L，或抗体结合变体或它们的片段(http://www.piercenet.com/method/antibody-igg-binding-proteins)。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白是截短通用抗体结合蛋白，优选是通常包含多个同源抗体结合结构域的蛋白，并且其被修饰以除去一个或多个抗体结合结构域。优选地，所述抗体结合蛋白是蛋白G。优选地，所述抗体结合蛋白是截短蛋白G。在一个实施方案中，所述蛋白质是从Sigma Aldrich(Paisley，UK)获得的截短蛋白G。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于30kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于25kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于20kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于15kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于10kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于8kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白的分子量小于5kD。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白是适配体(即DNA适配体)。在一个实施方案中，所述通用抗体结合蛋白是抗体的片段，例如单链可变片段。

在本说明书中，术语“截短通用抗体结合蛋白”应理解为是指被修饰以除去部分蛋白质的通用抗体结合蛋白。在荧光偏振测定中已经发现，减少通用抗体结合蛋白的MW会增加缀合物的信号。在一个实施方案中，除去至少一个抗体结合区。在一个实施方案中，除去不参与抗体结合的蛋白部分。该术语通常包括截短蛋白质和通用抗体结合蛋白的片段。在一个实施方案中，所述片段包括至少一个抗体结合结构域(例如实施例7中的gb1)。以截短蛋白G为例，可以除去三个抗体结合区中的一个或两个。以截短蛋白A为例，可以除去四个抗体结合区中的一个、两个或三个。截短蛋白质的实例是来自Sigma、Abcam和Molecular Probes的重组蛋白G，其分子量为约20kD的并且被修饰为除去了至少一个IgG结合结构域。另一个实例是肽gb1(参见以下的实施例7)，其是蛋白G的片段和分子量为7kD的组氨酸标签(his-tag)。Wilton等描述了截短蛋白G的片段(Proteins:Structure,Function and Bioinformatics,Vol.71,Issue 3,P1432-1440)。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于30kD的截短蛋白G。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于25kD的截短蛋白G。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于20kD的截短蛋白G。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于15kD的截短蛋白G。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于10kD的截短蛋白G。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于8kD的截短蛋白G。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于55kD的截短蛋白A。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于50kD的截短蛋白A。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于40kD的截短蛋白A。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于30kD的截短蛋白A。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于20kD的截短蛋白A。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于15kD的截短蛋白A。在一个实施方案中，所述截短通用抗体结合蛋白是MW小于10kD的截短蛋白A。

术语“变体”还意欲包括通用抗体结合蛋白的模拟物(即肽模拟物)和化学衍生物，即其中通用抗体结合蛋白的一个或多个残基是通过功能侧基的反应而化学衍生的。术语变体中还包括通用抗体结合蛋白，其中天然存在的氨基酸残基被氨基酸类似物替代。Dinon等描述了通用抗体结合蛋白变体的实例(J.Mol.Recognit.2011Nov-Dec；24(6))。

本发明中的和用于本发明的蛋白质和多肽(包括它们的变体和片段)可以全部或部分通过化学合成或通过核酸表达而产生。本发明中的和用于本发明的蛋白质和肽可以很容易地根据本领域公知的现有的标准液体或优选固相肽合成方法来制备(例如，参见J.M.Stewart and J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd edition,Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois(1984),in M.Bodanzsky and A.Bodanzsky,The Practice of Peptide Synthesis,Springer Verlag,New York(1984)。

在本说明书中，术语“荧光探针”或“荧光染料”或“荧光团”应理解为是指可在光激发下重新发光的荧光化学物质。荧光探针的实例是本领域技术人员公知的，包括荧光蛋白质如GFP、YFP和RFP，以及非蛋白质有机荧光团，其包括四吡咯衍生物、芘衍生物、呫吨衍生物和花青衍生物。

在本说明书中，术语“长寿命荧光染料”应理解为是指荧光寿命为至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20纳秒的荧光染料。优选地，所述荧光染料的荧光寿命为至少4ns。优选地，所述荧光染料的荧光寿命为至少5ns。优选地，所述荧光染料的荧光寿命为5-100ns、5-50ns、5-40ns、5-30ns或5-25ns，通常为10-100ns、10-50ns、10-40ns、10-30ns或5-25ns，以及理想地为15-100ns、15-50ns、15-40ns、15-30ns或15-25ns。优选地，所述荧光染料的荧光寿命为4-100ns、4-50ns、4-40ns、4-30ns或4-25ns，通常为10-100ns、10-50ns、10-40ns、10-30ns或5-25ns，以及理想地为15-100ns、15-50ns、15-40ns、15-30ns或15-25ns。在下表中提供了荧光染料的实例，包括长寿命荧光染料。

术语“生产细胞”是指用于产生特定的所需蛋白质的细胞。通常，基因修饰所述细胞以包括编码所需蛋白质的转基因的一个或多个副本，其通常在特定启动子的控制下。因此，所述特定蛋白质通常是重组蛋白质。生产细胞是本领域公知的，并且包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。理想地，所述生产细胞是CHO细胞。通常，所述生产细胞是单克隆抗体生产细胞。

在本说明书中，术语“高通量”应理解为是指可以同时测定大量样品(例如至少20、50、90、120，即20-500)的方法。

在本说明书中，术语“多孔板”是指具有多个孔(例如至少10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或384个孔)的板。在一个实施方案中，所述板可以是实心的非柔性板，或者可以作为柔性材料卷提供。

在本说明书中，术语“克隆生产细胞的组”应理解为是指来源于单细胞系并包含2至500或更多个克隆生产细胞群的克隆生产细胞群的组。产生克隆生产细胞的组的方法是本领域技术人员公知的，并被描述于Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells(2004),Wurm,Florian M,New York,NY,Nature Biotechnology 22(2004),S.1393-1398。通常，所述克隆生产细胞群的组包括10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500或100-500个克隆细胞群。通常，所述克隆生产细胞群的组包括100-500、100-400、150-400、150-350个克隆细胞群。

在本说明书中，术语“荧光偏振分析仪”应理解为是指一仪器，其能够接收样品并用波长对应于荧光染料的激发波长的平面偏振光激发样品，在两个平面中检测荧光染料以适当的发射波长发射的光强度，其中一个平面平行于发射平面并且另一个平面垂直于发射平面，以及通常确定激发光和发射光之间的偏振的变化。通常，该仪器能够接收和读取包含在多孔板中的多个样品，通常以高通量方式。荧光偏振分析仪的例子包括BMG PheraStar、BMG ClarioStar、Tecan Infinite F500。

实验

使用荧光标记的通用IgG结合蛋白评估IgG含量的实验方法。

丹磺酰蛋白A是由丹磺酰氯(5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氯)(Sigma，UK)与来自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aerueus)(Sigma，UK)的重组蛋白A的共价连接产生。

FITC标记的截短蛋白G是从Sigma,UK获得的。

免疫球蛋白G(人，活性)是从Abcam(Cambridge,UK)获得的。

使用BMG ClarioStar(Bucks，UK)进行荧光偏振测量。在黑色半区96‘非结合表面’的孔板(Corning,UK,产品3686)中进行读数。作为阴性对照的目标mP值为70mP。从荧光减去空白计算mP值。

评估丹磺酰标记的截短蛋白A缀合物。

这里将25ul的0.03mg/mL的稀释在水中的丹磺酰蛋白A与25ul的稀释在水中的全长人活性IgG1混合。样品混合后立即读数。图1显示了存在IgG的情况下，丹磺酰标记的蛋白A的荧光偏振影响。显然，使用该技术可以在该范围内精确定量IgG。随着IgG浓度的变化，mP有明显的剂量响应变化。

评估FITC截短蛋白G缀合物

使用市售FITC缀合的截短蛋白G(Sigma等)重复此技术。这里将25ul的0.03mg/mL的稀释在水中的FITC蛋白G与25μl的稀释在水中至各种浓度的全长人活性IgG1(Abcam等)混合。图2和4显示了存在IgG的情况下，FITC标记的蛋白G的荧光偏振影响。显然，该方法可用于在所观察的范围内给出IgG的精确定量。分辨率显然很高，并且可以容易观察到0.01g/L的差异。这表明该方法可以使用较短寿命的荧光团如FITC(异硫氰酸荧光素)。

比较短寿命荧光团与长寿命荧光团。

使用三种探针重复该技术，即(1)FITC-截短蛋白G，(2)BIODOPY-截短蛋白G和(3)Alexa647-截短蛋白G。这里，将30ul的0.02mg/mL的稀释在蛋白G结合缓冲液(sigma，UK)中的缀合物与30ul的稀释在CD-CHO中至各种浓度的全长人活性IgG1(Abcam等)混合。图6显示了在存在IgG的情况下，三种缀合物的荧光偏振影响。显然，该方法可用于在所观察的范围内给出IgG的精确定量。同样明显的是，使用具有较长寿命探针(FITC＝4ns，BIODOPY＝5ns)的缀合物获得的信号明显优于使用短寿命探针(Alexa647＝1ns)的缀合物获得的信号。

比较截短蛋白G与蛋白G片段

使用两种探针(即(1)与截短蛋白G缀合的FITC和(2)与含有单个IgG结合结构域的蛋白G的片段(gb1)缀合的FITC)重复该技术。这里，将30ul的0.02mg/mL的稀释在蛋白G结合缓冲液(sigma，UK)中的每种缀合物与25ul的稀释在CD-CHO中至各种浓度的全长人活性IgG1(Abcam等)混合。图7显示了在存在IgG的情况下，两种缀合物的荧光偏振影响。显然，使用蛋白G片段(<10kD)获得的信号明显优于使用截短蛋白G(20kD)获得的信号。

评估方酸菁轮烷染料(squarene rotoxane dye)-截短蛋白G缀合物。

使用方酸菁轮烷缀合的截短蛋白质G重复该技术。这里将30ul的0.02mg/mL的稀释在蛋白G结合缓冲液(sigma，UK)中的方酸菁轮烷蛋白G与30ul的稀释在CD-CHO培养基中至各种浓度的全长人活性IgG1(Abcam等)混合。图7显示了在存在IgG的情况下，缀合物的荧光偏振影响。显然，该方法可用于在所观察的范围内给出IgG的精确含量。方酸菁轮烷染料描述于http://chem.isc.kharkov.com/dep9/research-achievements。

评估荧光偏振法定量哺乳动物细胞培养基中的IgG。

评价稀释在培养基中的IgG样品的影响。这里将25ul的0.03mg/mL的稀释在水中的FITC蛋白G与25ul的稀释在CD-CHO(Life Technologies,Paisley,UK)中的全长人活性IgG1(Abcam等)的各种稀释液混合。图3显示了在存在稀释在CD-CHO培养基中的IgG的情况下，FITC标记的蛋白G的荧光偏振影响。

在存在非靶蛋白的情况下，评估mP的阴性对照。

作为阴性对照，将FITC蛋白G加入到与IgG浓度相当的浓度的各种浓度的未标记的蛋白A中。图5显示了在存在稀释在水中的未标记蛋白A的情况下，FITC标记的蛋白G的荧光偏振影响。在这里，显然，当使用非靶蛋白时，偏振没有系统性变化。

上述结果清楚地表明，本发明的方法可用于快速、经济和高通量的IgG抗体的定量。

本发明不限于上述实施例，在不脱离本发明的精神的情况下，可以在结构和细节上进行改变。