使用时空转换的成像流式细胞仪的制作方法
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本专利文件要求于2014年9月30日提交的标题为“使用时空转换的成像流式细胞仪(imagingflowcytometerusingspatial-temporaltransformation)”的美国临时专利申请第62/057,799号的权益和优先权。将上述专利申请的全部内容通过引用并入作为本申请公开内容的一部分。
本专利文件涉及流式细胞术系统、装置和过程。
背景
流式细胞术是一种用于测量和表征单个颗粒或细胞的技术。流式细胞仪可以包括与光学器件和/或电子器件耦合的流体系统，以分析移动通过流体系统的颗粒或细胞的特性。
概述
描述了对通过流式细胞仪检测到的信号进行时空转换，以在流式细胞术中提供单个颗粒或细胞的图像的技术、系统和装置。
在一个方面，用于在流式细胞术中使颗粒成像的方法包括：在携带含有颗粒的流体样品的流体通道传输光束，使得所述光束被所述颗粒散射或引起来自所述流体通道中所述颗粒的荧光发射；在空间滤光器接收散射的光或荧光发射的光，所述空间滤光器包括具有多个孔的表面，所述孔以沿着与颗粒流相反的横向方向和与颗粒流平行的纵向方向的模式布置，使得流经所述模式的孔的颗粒的不同部分在不同时间通过不同的孔，并在与所述孔相关的位置散射光束或发射荧光；基于来自所述携带流体样品的流体通道的至少一些所接收的散射的光或发射的荧光，编码包括所述颗粒的时空信息的光信号；通过光检测器检测编码的光信号；以及在与所述光检测器通信的数据处理单元处理检测到的光信号，以产生与流过所述流体通道的颗粒相关的图像数据，其中所产生的图像数据包括所述颗粒的物理特征的信息。
在一个方面，成像流式细胞仪系统包括：流体装置，其被构造成包括基板和设置在所述基板上以沿着颗粒流方向携带含有颗粒的流体样品的流体通道；光源，其用于在所述流体通道产生光束以照射所述流体样品，其中当被所述光束照射时，光被所述颗粒散射或引起来自所述颗粒的荧光发射；光检测器，其被布置在散射的光或荧光发射的光的光路中；滤光器，其位于所述光检测器的成像平面，并且被构造成包括具有多个孔的表面，所述孔以沿着与所述颗粒流方向相反的横向方向和与所述颗粒流方向平行的纵向方向的模式布置，使得流经所述模式的孔的颗粒的不同部分在不同时间通过不同的孔，并在与所述孔相关的位置散射光束或发射荧光，其中所述滤光器可操作以基于来自所述携带流体样品的流体通道的至少一些所接收的散射的光或发射的荧光，编码包括所述颗粒的时空信息的光信号，使得编码的光信号通过所述光检测器被检测到；以及与所述光检测器通信的数据处理单元，所述数据处理单元处理所述编码的光信号以产生与流过所述流体通道的颗粒相关的图像数据，其中所产生的图像数据包括所述颗粒的物理特征的信息。
在一个方面，用于编码来自在流体通道中流动的颗粒的光信号的空间滤光器包括具有多个孔的基板，所述孔以沿着与在所述流体通道中流动的颗粒的颗粒流方向相反的横向方向和与在所述流体通道中流动的颗粒的颗粒流方向平行的纵向方向的模式布置，其中所述空间滤光器可操作，以便当位于光束照射的所述流体通道的照射区域与光检测器之间的光路时，编码来自在所述流体通道中流动的颗粒的光信号，其中所述空间滤光器位于所述光检测器的成像平面，其中所述空间滤光器可操作以便基于流经所述模式的孔的颗粒的不同部分在不同时间通过不同的孔，并在与所述孔相关的位置散射光束或发射荧光，来编码所述光信号，其中基于来自所述流体通道的至少一些所接收的散射的光或发射的荧光，所述编码的光信号包括所述颗粒的时空信息。
本专利文件中描述的主题可以以提供以下特征中的一种或多种的具体方式实施。例如，本公开的系统、装置和方法包括设计的空间滤光器和信号处理技术，以提供流式细胞仪成像能力。例如，本公开的技术可以提供在流式细胞仪中快速移动细胞的高品质图像，其为使用例如，能够以与现有细胞仪完全兼容的方式获得高通量的光电倍增管(pmt)检测器获得的，且可以采用所述光电倍增管(pmt)检测器代替常规ccd或许多成像系统中发现的任何百万像素相机。可以应用本公开的技术来将传统的流式细胞仪以最低成本改造成成像流式细胞仪。使用本公开技术的示例性实施结果显示，在微流体通道中以0.2m/s的速度行进的细胞的成像，对应于大约1，000个细胞/秒的通量。
附图简述
图1a和1b显示本公开技术的示例性成像流式细胞仪系统的原理图。
图1c显示成像流式细胞仪系统的示例性电子系统的框图。
图2a和2b显示由光电倍增管(pmt)信号复原细胞图像的数据图和图解。
图3a-3c显示呈现基于空间滤光器的流式细胞术成像和宽场荧光成像的比较的数据图。
图4显示来自本公开的基于空间滤光器的成像流式细胞术的反向散射细胞图像的示例性数据。
图5a显示成像流式细胞仪系统的示例性实施的费雷特(feret’s)直径(也被称为最大卡尺)的直方图。
图5b显示图5a的直方图中，2μm至15μm的每个接收器(bin)的两个示例性反向散射图像。
图6显示使用相移空间滤光器(pssf)描述本公开技术的示例性成像流式细胞仪的图解。
图7显示描述使用配置有调频的空间滤光器的本公开技术的示例性成像流式细胞仪的图解。
图8显示在通过示例性成像流式细胞术系统实施的流式细胞术中，以多色细胞成像为特征的示例性数据的图像。
图9显示来自由本技术的示例性成像流式细胞术系统产生的图像数据的多功能输出的原理图。
图10显示通过将空间滤光器应用至常规流式细胞仪来呈现本技术的示例性成像流式细胞仪的设计和输出的图解和图像。
图11显示使用空间频率滤光器来复原细胞荧光图像的呈现本技术的示例性成像流式细胞仪的设计和输出的图解和图像。
图12显示可以并入具有最大兼容性的常规流式细胞仪中的多路复用空间频率滤光器的示例性设计。
详述
流式细胞术可以用于当细胞在液流中流动通过激发光束时，分析大量单细胞的多种物理特征。在一些应用中，流式细胞仪测量荧光和光散射，由其获得关于单细胞的生物性质和物理性质的信息。虽然流式细胞仪由于其单细胞分辨率和高通量而具有大量统计的功效，但它们不能产生通过其它表征如显微镜提供的关于细胞形态或空间分辨率的信息。测定细胞形态和/或空间分辨率的能力将是流式细胞仪中有价值的特征。本公开的技术提供具有细胞成像能力的流式细胞仪。
描述了对通过流式细胞仪检测到的信号进行时空转换，以在流式细胞术中提供单个颗粒或细胞的图像的技术、系统和装置。
本公开的技术包括使用设计的空间滤光器和数据处理技术，以提供流式细胞仪成像能力。例如，本公开的技术可以提供在流式细胞仪中快速移动的细胞的高品质图像，其为使用例如，能够以与现有细胞仪完全兼容的方式获得高通量的光电倍增管(pmt)检测器获得的，并且可以采用所述光电倍增管(pmt)检测器代替常规ccd或许多成像系统中发现的任何百万像素相机。可以应用本公开的技术来将传统的流式细胞仪以最低成本改造成成像流式细胞仪。使用本公开技术的示例性实施结果显示在微流体通道中以0.2m/s的速度行进的细胞的成像，对应于大约1,000个细胞/秒的通量。
本技术的背景和介绍
细胞成像和高通量单细胞分析是一些用于研究细胞和分子生物学以及医学的基本技术。显微镜被认为是生物学和医学中重要的成像工具，并且能够产生带有非凡细节的细胞图像，例如，如来自细胞的具体大分子、细胞器或亚基的荧光图像。然而，显微镜经由相对低通量的成像产生信息。考虑到生物对象如癌细胞和经历生命周期的不同阶段的细胞的多样化性质，从非常大的细胞群(例如，数千至数百万)的个体特性可以实现对细胞和组织特性的很大改进的理解。显微镜技术的有限通量已经成为研究生物样品的多样化特性的障碍。
流式细胞术是支持非常高的通量分析的强大工具，使得能够以数百个细胞/秒至超过100,000个细胞/秒的速度检测单细胞特性。当液流中的每个细胞流动通过被光束如激光束照射的光学探询区的区域时，流式细胞仪可以测量和分析细胞的多个物理参数，其包括细胞的相对大小、细胞核粒度和来自特定标志物或成分的荧光。然而，常规流式细胞仪不产生空间分辨率，因为显微镜不允许详细研究在许多应用中所需要的细胞特性。作为说明性类比，流式细胞仪可以从一大群人中快速地区分男性和女性，而不能识别每个个体的面部特征，反之成像细胞仪可以揭示每个人的详细面部特征，但不能对大量需要被研究的人足够快地执行该功能。
尽管有以上约束，但由于流式细胞仪的高通量、单细胞分辨率和与细胞分选能力的兼容性，流式细胞仪已经被广泛地用于生物医学研究，并且在临床中发挥越来越大的作用。然而，没有高空间分辨率(其含有对诊断和细胞分析至关重要的有价值的表型和形态学信息)是当前流式细胞术技术的缺点，并且提供了将成像能力并入流式细胞术的强烈动机。流式细胞术可以从成像能力中获益，该成像能力将以高通量区分在流体通道中探询的颗粒或细胞的特性。
迄今为止，在该领域中唯一成功的努力是amnis/millipore研发的成像流式细胞仪(例如，imagestream)。与所有其它流式细胞仪显著不同，amnis流式细胞仪依赖于具有大量像素的时间延迟和积分(tdi)高速电耦合装置(ccd)相机，与利用光电倍增管(pmt)的高速和极好灵敏度的几乎全部现今的流式细胞仪中使用的pmt不同。amnis系统比常规流式细胞仪昂贵地多，并且由于其独特的操作要求和光学设计，尚未准备好整合细胞分选功能。因此，尽管流式细胞仪中强烈渴望这种吸引人的特征，但仅非常小数目(例如＜5％)的现今部署的流式细胞仪获得成像能力。
本公开的技术包括为流式细胞仪提供成像能力的时空转换技术。在一些实施方式中，例如，将特别设计的空间滤光器放置在流式细胞仪中的pmt检测器的前面，以产生荧光或散射信号的时间波形。由空间滤光器编码的该波形含有映射细胞信号的空间分布所需的所有信息，从而允许从时域波形构建细胞图像。示例性设计与常规流式细胞仪的现有光学设计兼容，并且可以被容易地实施以使常规流式细胞仪以最低成本升级成为具有细胞成像能力的流式细胞仪。本文中实施并描述了本公开技术的示例性实施方式，其显示本技术的示例性流式细胞仪装置中a549人肺腺癌上皮细胞的单细胞图像(例如，图1a所示)。在此类实例中，细胞的流速为0.2m/s，对应于大约1，000个细胞/秒的通量。本公开的技术优于现有的百万像素成像装置。例如，现今几乎所有成像系统采用的基于ccd或cmos的技术需要相对长的积分时间(或曝光时间)来逐帧捕获图像，因此对高速行进的成像细胞具有速度限制。
在一个方面，在流式细胞仪中使颗粒成像的方法包括：在流体通道传输光束以照射含有颗粒的流体样品，以影响由空间布置在流体通道附近的孔的模式接收的光(例如，散射或发射)，其中孔的模式包括被构造成形成布置在基板上的多个狭缝的基板，使得流过所述模式的孔的颗粒的不同部分将在不同时间通过不同的狭缝，并且散射光束以产生光散射信号或发射光(例如，荧光发射)以产生光发射信号，基于孔的模式来编码来自光散射或发射信号的光信号，其中编码的波形包括颗粒的空间和时间信息，以及检测编码的光信号以产生与所述颗粒相关的图像数据。
本技术的示例性实施方案
公开了本技术的成像流式细胞仪装置、系统和方法的示例性实施方案。图1a和1b显示示例性成像流式细胞仪系统100的图解。系统100包括：含有微流体装置或芯片101的流体系统，用于将细胞引入流体通道(例如，具有微米级尺寸的微流体通道)；光学系统，用于光信号的照射和检测；以及电子系统120，用于数据采集和处理。成像流式细胞仪系统100的光学系统包括：二向色镜(dm)112、空间滤光器(sf)111、光源发射器(例如，激光)116；和一个或多个与电子系统120电连通的光电倍增管(pmt)114。
如图1a的实例中所示，成像流式细胞术系统100的光学系统被配置成，使得光源发射器116可操作以便在二向色镜112b发射光，所述二向色镜112b引导在微流体装置101的流体通道中照射区域的光。例如，光源116可以包括激光，例如，半导体激光二极管或hg-arc灯，以及其它光源。成像流式细胞术系统100的光学系统被配置成，使得空间滤光器111被布置在来自微流体装置101的照射区域的反射光的光路中，以接收来自样品的发射和/或散射光(例如，荧光发射和反向散射光)，以及基于空间滤光器111的开口模式来编码所接收的光。在一些实施方式中，例如，光学系统可以包括物镜117，其被配置在接收来自微流体装置101的照射区域的反射光的光路中，以使反射光聚焦在空间滤光器111上。编码的光从空间滤光器111传递至第二dm112a，其将在一个或多个光路中的编码的光引导朝向宽场荧光显微镜配置中的pmt或多个单独的pmt。在图1a中示出的示例性实施方案中，第一pmt114a被布置在第一光路以接收在流体通道中流动的颗粒的荧光发射，以及第二pmt114b被布置在第二光路以接收在流体通道中流动的颗粒的反向散射信号。例如，成像流式细胞术系统100的光学系统可以包括：在第一光路中的发射滤光器113和第一透镜115a，以过滤编码的荧光并使其聚焦至pmt114a中，以及在第二光路中的第二透镜115b，以使编码的反向散射光聚焦至pmt114b中。
图1b显示微流体装置101的原理图，所述微流体装置101包括流体通道，在该流体通道中，悬浮的细胞或颗粒在通过鞘流控制的流体中被携带，从而在流体通道的中央匀速行进。微流体装置101被构造成包括基板105，其上设置有流体通道以携带含有颗粒(例如，细胞)的流体样品。在一些实施方式中，例如，基板105可以包括基板基底和与所述基底连接的整块材料，其中所述整块材料包括从与基底接触的表面切出的流体通道。例如，基板可以包括聚二甲硅氧烷(pdms)材料。在一些实施方式中，例如，所述整块材料可以包括pdms，且基板基底可以包括玻璃或其它刚性电绝缘材料以支承具有通道的整块材料。在一些实施方式中，流体通道被构造成具有比微米级(例如，毫米)大的宽度和/或高度尺寸；然而在其它实施方式中，流体通道被构造成具有微米级(例如，微米)或更小(例如，纳米)的宽度或高度尺寸。例如，以下实例将流体通道称作微流体通道。在一些实施方式中，如图1b的图解中所示，微流体通道源于多个通道，例如，包括接收和携带含有颗粒的流体样品的通道，以及一个或多个鞘通道。微流体装置101的微流体通道被构造成传输由成像流式细胞术系统100的光学系统接收的探测光，例如，如从激光116接收的激光。在一些实施方案中，例如，空间滤光器111可以被配置在照射区域的通道上方的微流体装置101上。
空间滤光器111形成包含被布置成相对于微流体通道光学对准的开口模式的掩模。开口模式基于通过微流体通道传输的探测光和空间滤光器111的模式设计来编码波形，来自其的波形可以使用本技术的数据处理技术进行解码，以(i)光学检测微流体通道中颗粒的物理特征(例如，位置、尺寸等)，以及(ii)形成包含该物理特征的颗粒的图像。系统100的空间滤光器111的示例性空间滤光器设计，显示在图1a的图解的右边。空间滤光器的图示描述一种设计的空间滤光器设计，其具有在x-方向(横向于流动方向)和y-方向(纵向于流动方向)以一个紧接另一个的方式分开放置的10个100μm×1mm的狭缝。例如，图1a中示出的示例性狭缝的100μm尺寸在x-方向；以及狭缝的1mm尺寸在y-方向。x-和y-方向被标记在图1b中。可选地，例如，空间滤光器111可以在狭缝串联的前面分别在x-和y-方向具有两个100μm×1mm的狭缝，其中该示例性空间滤光器设计可以应用于精确计算每个细胞的细胞行进速度。在一个实例中，每个狭缝可以被配置成在纵向和横向尺寸上分别具有特定的长度和宽度，使得每个狭缝定位于紧接其相邻狭缝的纵向和横向坐标以外的空间滤光器。在另一实例中，空间滤光器111可以包括开口模式，其中至少两个开口具有相对于穿过微流体通道的流体流动方向的变化的纵向和横向尺寸(例如，对角线)，使得编码的波形携带包括颗粒在两个维度中的位置信息。一些这样的实例显示在美国专利第9,074,978号中，将其通过引用整体并入作为本专利文件公开内容的一部分。
图1c显示成像流式细胞仪系统100的示例性电子系统120的框图。电子系统120包括数据处理和通信单元125，其包括处理器121(例如，如中央处理单元(cpu)或微控制器)，以处理通过成像流式细胞仪系统100的光学系统获得的数据。数据处理和通信单元125包括与处理器121通信的存储和/或缓冲数据的存储器122。数据处理和通信单元125包括与处理器121通信的输入/输出(i/o)单元123，其提供与典型数据通信标准兼容的有线和/或无线接口(也被称为通信接口)，用于将该计算机与其它计算机和计算机系统或外部接口、数据存储源或显示设备(例如，如图1c中示出的显示设备124)等通信。例如，存储器122可以包括处理器可执行代码，其在由处理器121执行时配置数据处理和通信单元125以进行各种操作，如接收信息、命令和/或数据，处理信息和数据，以及向另一实体或向用户传输或提供信息/数据。例如，i/o单元123可以包括使用以下标准通信接口中的一个或多个来提供有线或无线通信的收发器，所述标准通信接口例如，包括但不限于：通用串行总线(usb)、ieee1394(firewire)、蓝牙、蓝牙低功耗(ble)、zigbee、ieee802.11(wi-fi)、无线局域网(wlan)、无线个人局域网(wpan)、无线广域网(wwan0、wimax、ieee802.16(全球互通微波存取(wimax))、3g/4g/5g/lte蜂窝通信方法和并行接口等。在系统100的一些实施方式中，例如，数据处理和通信单元125可以与光学系统进行数据通信，以存储和管理与光学系统的操作相关的数据，例如，如参数、设置等。
在图1a的成像流式细胞仪的示例性操作中，例如，将悬浮颗粒(例如，细胞)引入微流体通道，并通过鞘流在流体动力学上聚焦，例如，确保细胞在流体通道的中心匀速行进。来自样品的荧光发射和反向散射光由宽场荧光显微镜配置中两个单独的pmt检测。在该示例性操作中，细胞在微流体装置的微流体通道中流动，例如，微流体装置可以由结合至玻璃基底的软模制pdms制成。为了适应微流体装置的几何形状，通过放置在50×物镜前面的微型45度二向色镜(dm)(na＝0.55，工作距离＝13mm)，将激光束引入流体通道中的光学探询位置。45度二向色镜的尺寸足够小，以允许反向散射光(相对于正常入射光147°至168°)绕过二向色镜并进入物镜。将本公开的空间滤光器，例如，如具有图1a中示出的模式的sf，插入在光学系统的图像平面处的检测路径中。来自行进细胞(或颗粒)的荧光和反向散射光均由物镜收集，并通过滤光器，然后到达它们各自的pmt检测器。另一个二向色镜(dm)通过其光谱分离光，以将期望的发射频带按路线发送至适当的pmt。每个pmt的输出被发送到计算机系统并被处理，以由荧光和反向散射生成细胞图像。虽然图1a中描述的示例性系统仅显示一个用于荧光信号检测的pmt，但应理解可以添加更多的pmt，以及如果必要的话，更多的激发激光束，以产生如在任何常规流式细胞仪中的多色荧光信号。
从光强度分布复原细胞图像。本公开的技术包括对检测到的信号进行时空转换的技术，其可以以下述关系表示：
s(t)＝∫x，y细胞(x，y-mvt)·f(x，y)·i(x，y)dxdy(1)
其中s(t)是测量的pmt信号，“细胞”是二维细胞(或颗粒)荧光或散射强度分布，f(x，y)是空间滤光器的特征函数，i(x，y)是激光照射的强度分布，y是细胞行进方向，x是横向方向，以及m是与流式细胞仪有关的光学系统的放大因数。
当细胞(或颗粒)在微流体通道中以速度或速度v行进时，投射到空间滤光器上的图像以有效速度mv行进。为简化求解方程式(1)中细胞的数学过程，例如，f(x，y)可以被选择为方程式(3)中代表的一系列矩形函数，以及i(x，y)可以被选择为来自均匀强度的激光束的常数。
其中x＝1，2，...，n是空间滤光器中的行数，l是传输荧光或散射光的矩形狭缝的长度。例如，方程式(1)可以被改写为：
例如，可以通过使用方程式(3)的时间导数求解“细胞”
假设细胞方向在如此短的时间间隔内不变化，方程式(4)可以表示为如下：
为获得方程式5，使用的是y′＝y-mvt。当细胞大小未超过狭缝长度l时，在特定的时间间隔内
检测到的光信号包括基于颗粒通过通道时在每个狭缝的特定时间和空间位置的编码信息。由于成像流式细胞仪系统100可以测量微流体装置101的微流体通道中流动的颗粒的速度(v)，已知光学系统(m)的放大倍数，以及基于预定狭缝的几何形状已知狭缝的特征函数f(x，y-mvt)，可以通过用已知的特征函数f(x，y-mvt)对测量的信号进行去卷积来计算颗粒(例如，生物细胞)上每个点产生的信号。计算的来自颗粒(例如，细胞)的“局部化信号”基本上是颗粒的“图像”。例如，如果测量的信号来自光散射，则信号处理之后的重构图像是“散射图像”，其中“亮区域”是最强散射效率的区域。例如，如果测量的信号由荧光(例如，荧光标记的蛋白)产生，则重构图像是“荧光图像”，显示标记蛋白的局部分布和浓度分布。例如，如果荧光标记的蛋白是膜蛋白，则图像的轮廓给出的是细胞形状和大小。另一方面，如果细胞核被荧光标记，则构建的图像变成细胞核的图像。通过实施本技术的数据(图像)处理方法，可以产生所有这些不同类型的图像，其代表这些颗粒(例如细胞)的不同性质，并且这些产生的图像也可以被叠加以产生流动颗粒(例如，细胞)的高信息含量的图像。
在一些实施方案中，例如，数据处理方法包括在至少两个维度上确定颗粒的位置或速度。数据处理方法包括确定空间滤光器的特征函数(例如，f(x，y-mvt))，其中所述特征函数包括与模式的孔的尺寸和布置相关的参数。数据处理方法包括确定与颗粒的一个或多个部分(例如，细胞区域)相关的局部信号，以产生与颗粒相关的图像数据。例如，数据处理方法可以通过使用确定的特征函数对颗粒信号进行去卷积来确定局部信号数据，其中颗粒信号包括所检测到的光信号、所确定的位置或速度、在空间滤光器聚焦所接收的发射和/或散射光的光学系统的放大倍数。
通常，空间滤光器被设计成使得在图像平面处，来自颗粒(例如，细胞)的不同部分的荧光将在不同时间通过不同的狭缝。因此，来自pmt的荧光信号的波形包括在时域中分离的模式序列，并且时域中信号的每个部分对应于细胞(或颗粒)的每个特定状态(regime)产生的荧光(发射和/或散射)信号。在接收每个狭缝上的光强度分布之后，可以通过将所有的分布拼接在一起构建整个细胞的细胞图像。
在一些实施方式中，例如，细胞图像构建的数据处理技术可以包括以下表达式：
其中i是构建的细胞图像的行数，j是列数，n是来自一行的pmt信号的数字采样点的数目，si(t)是代表细胞的第i行的光强度的pmt信号，以及细胞i(j)是对应于测试中细胞的第i行和第j列的光强度。
例如，在系统100中采用50×物镜(m＝50)的实施方式中，滤光器设计允许使用方程式(6)中所述的本公开数据处理算法构建20μm×20μm的行进细胞的荧光或散射图像。本公开技术的数据处理技术提供最小量的计算，并且适合于高通量、基于实时图像的细胞分类和分选。
本技术包括在流式细胞仪中使颗粒(例如，细胞)成像的高通量、实时方法，其可以被用于颗粒或细胞分类和/或分选。该方法可以包括将含有颗粒(例如，细胞)的流体样品转移到流体装置(例如，装置101)的流体通道中。该方法包括在携带含有颗粒(例如，细胞)的流体样品的流体通道传输来自光发射器(例如，激光116)的光束，使得光束受到流体通道中颗粒的影响(例如，散射)和/或影响流体通道中的颗粒(例如，引起其荧光发射)。该方法包括在空间滤光器(例如，空间滤光器111)接收散射或荧光发射的光(例如，通过经由物镜117的聚焦)。例如，空间滤光器包括具有预定几何形状并且布置在空间滤光器上的多个孔(例如，狭缝)的表面，其中孔的模式沿着与颗粒流相反的横向方向和与颗粒流平行的纵向方向，使得流过孔的模式的颗粒(例如，任何颗粒)的不同部分在不同时间通过不同的孔，并在与孔相关的位置散射光束或发射荧光，例如，其可以产生携带关于颗粒信息的光散射或发射信号。该方法包括基于来自携带流体样品的流体通道的至少一些所接收的散射光，来编码包含所述颗粒的时空信息的光信号。该方法包括通过光检测器(例如，一个或多个pmt114)检测编码的光信号。该方法包括处理检测到的光信号以产生与流过流体通道的颗粒相关的图像数据，其中产生的图像数据包括颗粒的物理特征的信息。例如，在确定的图像数据中颗粒的物理特征可以包括：颗粒的尺寸(例如，至少两个维度)、颗粒的空间特征或几何形状(例如，至少两个维度)、颗粒的内部特征或结构的位置和/或浓度(例如，至少两个维度)，例如细胞器，如细胞核、线粒体或细胞中的寄生物质(例如，病毒、毒素或其它非天然物质)。
所述方法的实施方式可以包括以下特征中的一种或多种。在一些实施方式中，例如，所述方法还包括基于所产生的图像数据形成颗粒的图像，其中所述图像包括颗粒的物理特征的视觉呈现。在所述方法的一些实施方式中，例如，随着颗粒在流体通道中流动，处理检测到的光信号是实时的。在所述方法的一些实施方式中，例如，处理检测到的光信号包括：在至少两个维度上确定颗粒的位置或速度；确定空间滤光器的特征函数，所述特征函数包括与模式的孔的尺寸和布置相关的参数；以及通过用确定的特征函数对颗粒信号进行去卷积，来确定与颗粒的一个或多个部分相关的局部信号以产生与颗粒相关的图像数据，其中颗粒信号包括所检测到的光信号、所确定的位置或速度、在空间滤光器聚焦所接收的散射的光或荧光发射的光的光学系统的放大倍数。在一些实施方式中，例如，所述方法还包括基于颗粒的确定的物理特征分选颗粒。例如，在所述方法的一些实施方式中，孔的模式包括两个或更多个分开放置的狭缝，使得相对于流体通道中颗粒流的纵向方向(y-方向)和与所述纵向方向垂直的横向方向(x-方向)，相邻狭缝位于狭缝的覆盖区之外。例如，在所述方法的一些实施方式中，孔的模式包括10个100μmx1mm的狭缝。例如，在所述方法的一些实施方式中，孔的模式包括狭缝组，其中每组狭缝包括三个平行的狭缝阵列，其在流体通道中颗粒流的纵向方向(y-方向)为移动的、空间分开的和非重叠的。例如，在所述方法的一些实施方式中，光束包括激光束。例如，在所述方法的一些实施方式中，光检测器包括光电倍增管(pmt)。例如，在所述方法的一些实施方式中，光检测器包括多个pmt，其中编码的光信号被分离成对应于多个pmt的多个光路。
示例性实施方式
通过模拟和实施来进行示例性实施方式以证明该方法，其中细胞图像被用作测试中的细胞，并且细胞以0.24m/s的速度行进通过照射光束斑点。图2a和2b显示由pmt信号复原细胞图像的数据图和图解。图2a显示示例性模拟结果：时域光强度信号、用于模拟的原始细胞图像和对应的复原图像。图2a中示出的示例性比例尺是5μm。通过空间滤光器上狭缝的荧光，以500khz的速率被采样。例如，原始细胞图像、以及通过空间滤光器的时域输出信号和使用示例性数据处理技术和算法复原的细胞图像显示于图2a中。与原始细胞图像相比，例如，来自模拟的复原图像显示相同的特征。注意，例如，复原的图像包括约1.5μm的分辨率，并且图像模糊主要是由于采样率限制和光衍射。
在示例性实施方式中，一旦将细胞注入微流体通道中，在图像平面插入双狭缝滤光器以确定细胞行进速度，然后应用上述空间滤光器。通过阈值化pmt读出捕获每个细胞的时域信号。图2b显示示例性实验结果：来自用celltracecfse染色的a549细胞的荧光的时域pmt输出信号，以及通过分割和拼接光强度分布来复原的荧光图像。尺寸标注在图中。图2b显示典型的pmt信号的实验结果和使用方程式(6)由pmt信号构建的荧光细胞图像。例如，x-(横向)方向上复原的图像的空间分辨率取决于空间滤光器上狭缝的数目，以及y-(细胞行进)方向上复原的图像的空间分辨率取决于采样率和细胞流速。在该示例性实施方式中，例如，使用50×/0.55na物镜、用于获取pmt信号的500khz采样率和0.2m/s的细胞行进速度，y-方向上像素的有效尺寸确定为0.4μm(例如，
所述成像流式细胞仪系统仅使用单个pmt代替像素化ccd就能进行快速荧光成像。
图3a-3c显示呈现基于空间滤光器的流式细胞术成像和宽场荧光成像的比较的数据图。在这些示例性数据中，所有图像均为用celltracecfse染色的a549人肺腺癌上皮细胞。图3a描述代表以20cm/s的速度流动的细胞的示例性成像流式细胞仪重构的荧光图像的数据图。图3b描述代表静止的a549细胞的宽场荧光图像的数据图。图3c显示代表性静止的a549细胞的共聚焦显微镜图像，例如，其中使用的物镜为63×/1.30。对于图3a、3b和3c，将所有图像的尺寸剪裁为20μmx20μm；并且示例性比例尺为5μm。
图3a的数据图显示在微流体通道中以0.2m/s流动的荧光标记的a549细胞的代表性荧光图像，产生约1，000个细胞/s的通量。为了比较，图3b的数据图显示在至少50ms曝光时间下，用ccd相机通过荧光显微镜捕获的载玻片和盖玻片之间的静止的荧光标记的a549细胞的图像。图3c的数据图显示来自通过共聚焦显微镜的相同批次的图像。所得的来自成像流式细胞仪的图像显得类似于来自荧光显微镜的静止细胞的图像，即使在成像流式细胞仪中，细胞以0.2m/s的速度行进，并且产生细胞图像的信号通过与常规流式细胞仪兼容的设置和配置中单个pmt检测。
表1显示通过示例性成像流式细胞仪系统和荧光显微镜获得的细胞图像的尺寸和形状描述符的比较。基于从每组随机挑选的100个细胞荧光图像，例如，通过成像流式细胞仪复原的图像中测量的细胞大小、圆度和固体性，与通过荧光显微镜拍摄的图像高度一致，除了被定义为拟合椭圆的长轴与短轴比率的纵横比。成像流式细胞仪与荧光显微镜之间的细胞纵横比的明显差异，可以归因于由流体动态剪切应力引起的细胞变形，携带关于细胞刚度、生物学意义的性质的信息。
表1.
反向散射图像。本公开的时空转换技术不限于特定的信号模式。在下文中，显示了该方法能够将荧光图像与反向散射图像组合。通过示例性成像流式细胞仪系统捕获的反向散射图像，揭示作为用于诸如疾病诊断、细胞分类和细胞周期监测的应用的有效标志物的细胞核独特性质。具有较高浓度大分子的细胞组分，表现出比背景高的折射率。当细胞被可见光照射时，这些折射率变化将使光散射。散射区域的尺寸和折射率分布决定散射光的角分布。大多数人类癌症起源于上皮细胞，因此反向散射图像可能潜在地有益于早期癌症和上皮内肿瘤变化的诊断。为证明用于细胞核监测的反向散射成像功能的可行性，使用成像流式细胞仪测试经历不同生命周期的a549细胞。
为了观察不同阶段的细胞，用抑制剂培养a549细胞以在不同的发育阶段使其停止生长。丝裂霉素被用于使g1期的细胞停止生长，其中细胞的生物合成活性被激活以形成下一阶段(s期)所必需蛋白。另外，诺考达唑被用于在g2/m期，更具体地在前中期停滞a549细胞。在前中期被停滞，核膜分解，并且细胞核的成分分布在细胞质内。没有由核膜限制的明确界定的细胞核，细胞通常在光散射中具有较强但没有明确界定的轮廓。
图4显示来自本公开的基于空间滤光器的成像流式细胞术的反向散射细胞图像的示例性数据。示例性图像为用celltracecfse染色的，以20cm/s的速度流动的a549人肺腺癌上皮细胞。图4的图块(a)显示停滞在g1期(顶部的两个，标记的图像401和402)和前中期g2/m(底部的两个，标记的图像406和407)的停滞细胞的静止细胞的代表性共聚焦图像。图4的图块(b)显示g1(顶部两行，标记的图像421、422、423、426、427和428)和g2/m(底部两行，标记的图像431、432、433、436、437和438)停滞细胞的代表性成像流式细胞仪图像。荧光图像显示于左列，反向散射图像显示于中间列，以及叠加图像显示于右列。图4的图块(b)中的荧光图像、反向散射图像和这两个图像的叠加，代表如图1a中示出的示例性成像流式细胞仪系统100中的行进细胞(例如，0.2m/s)。
通过两个系统获得的图像显示以下一般特性：在g1期停滞的细胞具有来自细胞核的明确界定的散射中心。相比之下，因为核酸和蛋白质的浓度较高在前中期的细胞显示整体较强的散射强度，但由于没有核膜而无明确界定的散射中心。
为体现在特定阶段停滞的细胞内散射细胞组分的体积，图4的图块(c)中显示在荧光图像上叠加反向散射图像的三维轮廓图。图4的图块(c)显示g1(顶部，标记的图像441和442)和g2/m(底部，标记的图像446和447)停滞细胞的荧光(绿色网状物)和反向散射(射流表面)图像的叠加的三维图。所有图像的尺寸剪裁为20μmx20μm，所有的比例尺为5μm。此外，来自时空转换方法的反向散射图像和共聚焦图像显示一致的亚细胞特征：g1期的细胞具有密集的散射中心；以及前中期的细胞具有更分散的散射区域。
对于传统的流式细胞术，例如，直方图为一种提供关于细胞群或亚群的信息的常见方式。与直方图相关的参数包括荧光或散射强度。然而，如果测试中的每个单细胞的图像可用于流式细胞术测试，则将更有信息量，使得做出关于门控的决定可以不再“无视”样品属性。而且，不仅可以量化光强度，而且可以基于测试中细胞的可用图像进行许多形态学测量。
图5a和5b显示在g1期和g2/m期停滞的细胞的反向散射图像的差异。图5a和5b的所有数据和图像为以0.2m/s的速度流动的a549细胞。为比较在g1和g2/m期停滞的细胞的反向散射图像，图5a显示费雷特直径(也被称为最大卡尺)的直方图。图5a的直方图中的嵌入图包括示出费雷特直径的定义(沿对象边界的任何两点之间的最长距离)的箭头。例如，测量来自各组的300个细胞图像。以蓝色条(条形图对的左条)显示的g1细胞，显示出具有大约3至4μm的费雷特直径。以红色条(条形图对的右条)显示的g2/m细胞，显示出具有较大的费雷特直径。代替纯数字表达，图5b显示直方图中2μm至15μm的每个接收器的两个示例性反向散射图像。在图5b中，热色条代表0至255的强度。所有细胞反向散射图像的所有尺寸为20μmx20μm；并且示例性比例尺为5μm。
本技术的示例性实施方案
在一些实施方式中，例如，图1a中示出的空间滤光器的示例性设计可以伴随有的200μm长的激光照射状态，由于滤光器在细胞流动方向(y-方向)的总长度而限制该装置的通量和灵敏度。为减少在第一个细胞离开滤光器区域之前，第二个细胞进入该区域时在颗粒流发生的重合事件的概率，以降低的样品密度操作。注意，例如，延长的照射区域(例如，由于长滤光器)也可能降低荧光强度并影响系统的灵敏度。
存在若干方法来克服上述具有改进的空间滤光器设计的约束。一种此类设计为相移空间滤光器(pssf)，其可以显著缩短整个滤光器长度来实现增强的通量和灵敏度。
相移空间滤光器。图6显示本公开的成像流式细胞仪系统600的另一示例性实施方案。系统600包括系统100的特征，但系统600包括在光学系统布置中的示例性相移空间滤光器(pssf)611而非空间滤光器111。空间滤光器611包括狭缝组，其中每组狭缝包括多个平行的狭缝阵列，其共有相同的周期，并且在细胞行进方向(纵向或y-方向)移动。图6中示出的示例性空间滤光器611包括每组三个平行的狭缝阵列：阵列1、阵列2和阵列3。以使所有狭缝在y-方向上空间分离(非重叠)的方式设计相移。因此，当细胞行进通过滤光器区域时，pmt记录来自细胞的荧光通过多于一个/不到一个狭缝时所有的光强度变化。然后，可以如下导出来自细胞的光强度分布：
其中g为从细胞进入侧至细胞离开侧观察到的组数，h为一组中的列数，n为来自一组的pmt信号的数字采样点的数目，sg(t)为代表来自第g组细胞的光强度的pmt信号剪裁，以及细胞g(h)为对应于目标细胞的第g组和第h列的光强度。
在获得一组细胞状态的光强度分布之后，可以通过如下将强度值分配给对应行来重构细胞图像：
细胞i(j)＝细胞g(3*c+i)c＝0，1，2，...常数(9)
其中i为第g组内的行数，并且j为一行中的列数。
使用该方法，通量可以比先前讨论的空间滤光器高三倍，因为一组中存在三行狭缝。所需的照射区域也可以通过相同因子收缩，产生3x高的有效激光强度以增强系统的灵敏度。
具有调频的空间滤光器。减少空间滤光器长度的另一方法为调频。图7显示描述使用具有调频的空间滤光器配置的本公开技术的示例性成像流式细胞仪系统700的图解。如同系统100，系统700包括含有微流体装置或芯片101的流体系统，其用于将细胞引入细胞微流体通道；包括具有调频的空间滤光器组的光学系统，其用于光信号的照射和检测；以及电子系统120，其用于数据采集和处理。成像流式细胞仪系统700包括：二向色镜(dm)112b、两个空间滤光器(sf1和sf2)711a和711b、光学光源发射器(例如，激光116)和光电倍增管(pmt)114。如图7的实例中所示，成像流式细胞术系统700的光学系统被配置成使得激光116可操作以便在二向色镜112b发射光，所述二向色镜112b引导微流体装置101的微流体通道中照射区域的光。成像流式细胞术系统700的光学系统被配置成使得第一空间滤光器(sf1)711a被布置在来自微流体装置101的照射区域的反射光的光路中，以接收来自样品的散射光(例如，荧光发射和反向散射光)，以及基于空间滤光器711a的开口模式在时间和/或空间上编码接收的光。在一些实施方式中，例如，系统700的光学系统可以包括物镜117，其被配置在接收来自微流体装置101的照射区域的反射光的光路中，以将反射光聚焦在空间滤光器711a上。例如，用于空间滤光器(sf1)711a的掩模设计位于检测路径中的图像平面处。在该实例中，空间滤光器711a包括三组狭缝，例如，以其中一个狭缝在x和y-方向均紧接另一狭缝的的方式分开放置的四个100μmx1mm狭缝的三个重复。编码的光从空间滤光器711a传递至光学系统的谐振扫描器(rs)719，其可以被配置成垂直扫描(例如，在10khz)。空间编码的光从rs719提供给第二空间滤光器(sf2)711b以编码光信号的频率。示例性空间滤光器(sf2)711b显示于图7中，其具有含有三个不同周期的三个平行的狭缝阵列，例如，其中一组具有40个周期，一组具有80个周期，以及另一个具有120个周期。两个空间滤光器711a和711b在光学系统的光路中对准，使得一个滤光器的三个狭缝组被相应地投射到另一滤光器的三个狭缝组。光学系统被配置成包括第二dm112a，其接收来自第二空间滤光器(sf2)711b的编码的光，并将编码的光引导至与电子系统120电连通的pmt114(或多个单独的pmt)。在图7中示出的示例性实施方案中，当pmt115收集通过这样的光学系统的光时，在该实例中所得的光强度信号是在400khz、800khz和1.2mhz调制的三个信号的叠加。电子系统120被配置成处理由pmt114提供的数据信号。例如，在对所得信号进行傅里叶变换之后，可以通过对具有已知载波频率的信号进行带通滤波处理来恢复每四行的光强度分布，然后可以使用本公开的数据处理算法来获得每行细胞图像。在使用荧光光信号的光学系统的实施方式中，例如，成像流式细胞术系统700的光学系统可以包括在光路中的发射滤光器113和透镜115，以将编码的荧光过滤和聚焦至pmt114中。
多通道光电探测器阵列。在本公开技术的一些实施方式中，本公开的成像流式细胞仪系统可以利用多阳极pmt作为光学系统中的光检测器。多阳极pmt相当于在单个外壳中并入多个pmt。由于常规的pmt为零维检测器，其中强度的空间信息丢失，并且被拦截全部二次电子的一个大的阳极合并，多阳极pmt提供一维信息-沿x或y-方向的强度的空间信息。通过使用多阳极pmt代替单通道pmt，构建的细胞图像的分辨率可以根据多阳极pmt具有的通道数目立即增加多倍。利用这样的光电探测器与以上讨论的三个空间滤光器设计中的任一个兼容，以提供较高的图像分辨率和/或较高的系统通量。
具有2个荧光色的细胞图像的示例。进行本发明的成像流式细胞术技术的示例性实施方式，以显示流式细胞术应用中的多色细胞成像。在示例性实施方式中，用celltracecfse(例如，520nm发射)对mda-mb-231人乳腺癌细胞进行染色，以及用1μm羧化修饰的荧光珠(例如，630nm发射)标记细胞，以获得使用本公开技术的示例性成像流式细胞仪系统的图像。图8显示使用本公开的成像流式细胞术技术的双色细胞图像。图8的图像中的示例性比例尺为5μm。图像显示1.0至1.5μm空间分辨率，其中图像以所述颗粒的多色内部特征及其在细胞中的空间分布为特征。
公开了使传统的流式细胞仪能够捕获在液流中以高速行进的细胞的荧光和反向散射图像的时空转换技术。本公开技术的图像质量与使用ccd或cmos相机的静止细胞的常规荧光显微镜成像的图像质量相当。由本公开的系统产生的空间分布反向散射图，不仅揭示相同类型细胞的共同性，而且显示它们的不均一性，其通过相同细胞类型经历不同生命周期来例示。由于设计的简单性和使用pmt(例如，而非ccd)来构建细胞图像，本公开的方法可以将现有的流式细胞仪转化或改造成具有单细胞成像能力的系统。虽然在示例性实施方式中使用的示例性装置和系统显示两个参数(例如，单色荧光和反向散射)的成像结果，但本公开的技术可以应用于利用另外的二向色镜和pmt产生多种荧光颜色的细胞图像。此外，本公开的技术可以以较高的流体流速工作，用于利用高速电子数据采集电子器件实现更高的空间分辨率和通量。
一些示例性实施方式的示例性材料和方法
微流体装置制造。使用聚二甲硅氧烷(pdms)复制成型方法制造示例性实施方式中使用的示例性微流体装置。通过反应离子蚀刻(rie)方法制造si模具主体。在autocad(autodesk，inc.)中绘制微流体通道，并且使用负性光致抗蚀剂(nr9-1500py，futurrex，inc.)进行光刻定义，所述负性光致抗蚀剂在随后的干蚀刻过程期间用作蚀刻掩模。使用电感耦合等离子体(icp)反应离子蚀刻(icprie；plasmalab100，oxfordinstruments)在室温蚀刻4-英寸硅晶片以达到75μm的深度。由o2和sf6气体的混合物点燃的等离子体进行蚀刻和侧壁钝化，产生光滑和垂直的通道壁。通过三氯硅烷(tciinc.)的气相沉积，使si模具主体硅烷化以促进pdms脱模。复制品通过以下制备：铸造pdms(sylgard184，dowcorning)，在si模具主体将基料与固化剂以标准的10∶1的比例混合。在烘箱中于65℃热固化3小时之后，将pdms层剥离模具，并且对入口和出口穿孔。用uv/臭氧处理脱模的pdms层和玻璃晶片的表面，以促进它们的共价键合而形成成像流式细胞仪实验的微流体通道。
光学系统。在示例性实施方式中使用的示例性光学系统，使用25mw488-nm单模光纤耦合激光器(例如，ftec2，blueskyresearch)，其具有高斯能量分布的圆形光束形状。使用顶帽光束整形器(osela，inc.)将高斯光束转化成均匀的顶帽分布，其照射100μm(x-方向)x350μm(y-方向)的区域。通过50×，0.55na物镜(mituyoyo)收集通过具有500nm截止波长(thorlabs)的微型二向色镜的荧光和散射光。通过pmt(h9307-02，hamamatsu)获得每个通道中的光强度信号，并使用labview进行记录。将保存的原始数据在实施上述算法的计算机上的matlab中处理。
空间滤光器的制造。在aotocad中绘制空间滤光器的设计，并以20,000个点/英寸(dpi)将其打印至透明掩模。将负性光致抗蚀剂(nr9-1500py，futurrex，inc.)层在6-英寸玻璃晶片上以3,000转/分钟(rpm)旋转。将晶片在150℃于热板上加热3分钟，然后通过透明掩模将其暴露于uv光(evg620nt，evgroup)。uv暴露后，将晶片在100℃烘烤另外3分钟，然后在rd6(futurrex，inc.)中显影12秒。将200nm厚的铝膜溅射到玻璃晶片上。在金属剥离之后，形成空间滤光器的模式，并且将玻璃晶片切成15mmx15mm的小块。为帮助保持流式细胞仪系统中的空间滤光器，将具有10个1mmx100μm狭缝的空间滤光器安装至通过3d打印方法制造的样品架上。
细胞样品的制备。从培养物收获a549人肺腺癌上皮细胞样品，并用在大约492nm和517nm分别具有激发峰和发射峰的celltracecfsecellproliferationkit(lifetechnologies)对其进行标记。在4％甲醛中孵育20min之后，洗涤a549细胞并将其重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。在每个成像实验之前，将悬液在pbs中稀释至200个细胞/μl的浓度。为在g1期停滞a549细胞，将溶解在dmem中的丝裂霉素(10μg/ml)与0.5％fbs和1％ps混合并添加至培养基中，然后在实验前将细胞孵育3小时。为在g2/m期停滞细胞，将在dmem中的50ng/ml诺考达唑与0.5％fbs和1％ps混合后添加至培养基，并将细胞培养16小时。用pbs洗涤在设计阶段停滞的细胞，并将其悬浮在4％甲醛中。将细胞悬液在室温保持20分钟之后，将样品以1000rpm离心10min，并小心地弃去细胞悬液的上清液。在用pbs洗涤留在管中的样品后，将固定的细胞重悬于pbs中至200个细胞/μl的浓度。
细胞形态学特征的测量。来自成像流式细胞仪的输出图像代表20μmx20μm的区域；来自荧光显微镜(bz-9000，keyence)的细胞荧光图像也被剪裁至相同面积。例如，为测量由成像流式细胞仪复原的，以及通过荧光显微镜拍摄的两个细胞图像的形态学特征，使用imagej处理所有图像。将包含来自每个系统的100个图像的两个图像序列导入到imagej。在将测量设置为包括区域和形状描述符之后，使用命令“分析颗粒”以测量共存的阈值图像。基于来自imagej的结果计算表1中的平均值和标准差。对于反向散射图像的费雷特直径测量，使用imagej中的相同方法分析来自各个g1停滞细胞和g2/m停滞细胞的300个图像。例如，为避免由于不连贯模式而导致的一个图像的多次测量，尤其是在g2/m停滞细胞的反向散射图像中，将包括g1和g2/m细胞图像两者在内的所有图像平滑两次并同时阈值化，并且仅记录每个图像中最大的费雷特直径。
示例性应用
本公开技术的应用期望为通过使本文公开的示例性装置和系统成为便携式的、负担得起的和使用方便的，来使常规和基于图像的细胞-分选流式细胞术成为日常的实验室工具。在一些实施方式中，例如，在流式细胞术应用期间，本公开技术的简单的空间-频率滤光器可以与流式细胞仪(例如，常规流式细胞术传感器)一起使用以编码图像信息。在针对新兴市场的应用，如干细胞研究中，例如，迫切需要开发和得到负担得起的、用户-友好的系统，其也可以生成针对更复杂分析的图像。
流式细胞术允许快速分析成千上万个细胞的特性，如大小(，前向散射)、粗糙度(侧向散射)和一种或多种荧光标志物的强度。然而，由于细胞快速移动通过光学检测区，图像信息难以获得。目前，存在一些技术上复杂的成像流式细胞仪，但它们比常规流式细胞仪复杂和昂贵得多，因此很少购买或使用。此外，由于将细胞分选与现今的成像流式细胞术结合的技术复杂性，已知的成像流式细胞仪不具有分选细胞的能力。在收集图像信息时常规流式细胞术特性快速表征细胞的能力，将使得能够进行另外重要的表型细胞特征，如细胞溶质相对于核蛋白的表达/定位的位置，以促进生物医学发现；并且这些能力期望由本技术的成像流式细胞术系统、装置和方法提供。
本公开的技术提供在利用光检测器(例如光电倍增管pmt)测量之前，通过使来自细胞的荧光发射通过空间多路复用和/或空间频率多路复用滤光器，来构建行进颗粒(例如，细胞)的图像的系统、装置和方法。例如，pmt可以在高频下操作，然后可以用滤光器的预定空间和频率特性对其输出进行去卷积，以构建对大多数应用具有足够(例如2μm或更小)分辨率的细胞图像。本公开的技术可以仅使用滤光器作为另外的硬件来实施，以提供具有细胞成像能力的任何流式细胞仪。本技术的光学空间和/或空间频率滤光器可以例如，利用光刻掩模技术以低成本容易地大批量制备；并且本公开的技术期望应用于新的流式细胞仪或甚至改造现有的流式细胞仪以获得实质的性能升级。此外，用于产生行进细胞的荧光图像的本公开技术的相同原理，也可以被实施以产生未标记细胞的光散射(例如，反向散射)图像。使用该方法，可以第一次对行进的未标记细胞细胞的内部结构(例如，细胞核)成像，这是目前任何流式细胞仪不具备的独特且可用的能力。
图9显示来自本技术的示例性成像流式细胞术系统产生的图像数据的多功能输出的原理图。例如，常规流式细胞仪由于细胞在检测区的快速移动而缺乏定义空间信息的能力。此外，例如，细胞的表型特性可以用常规显微镜揭示，但不允许高通量细胞分析或分选。图9的图解示出通过使用空间和/或空间频率滤光器来编码图像信息以产生编码信号的示例性流式细胞术方法，所述编码信号可以由数据处理算法转换以产生图像数据并渲染图像，其将颗粒的物理特征，例如，诸如细胞特征，如细胞质与细胞核染色区分开来。此外，本公开的技术可以以使细胞能够同时成像和分选的微流体分选流式细胞仪来实施。
在一些实施方式中，例如，光学空间和/或空间频率滤光器可以放置在一个或多个光电倍增管(pmt)检测器的前面。示例性滤光器可以包括在每列狭缝中的具有周期性结构(例如，空间频率)的狭缝矩阵。来自行进细胞的荧光或散射信号在到达pmt之前通过该滤光器。然后，来自pmt的所得信号由滤光器调制的多路复用信号组成。pmt信号的时域和傅立叶域分析产生对应于由细胞的不同区域产生的荧光的唯一时间和频率特征的信号。然后，可以应用本公开的数学算法来解码不同特征的信号，并构建整个细胞的荧光图像。对于用不同荧光团标记的细胞，可以叠加每种颜色的荧光图像以产生荧光图像。此外，例如，对于未标记细胞细胞，可以从用于wbc分类或细胞周期检测的散射(例如，反向散射)信号获得其内部(例如细胞核)结构图像。所得的图像显得与用荧光显微镜观察到的静态细胞的图像类似，即使在流式细胞仪中，细胞实际上以几米/秒的速度行进，并且图像仅通过几个pmt(每个pmt一种颜色)而非像素化的高速成像器被检测到。本公开的技术期望提供重大突破，其可以潜在地变革流式细胞术领域，并且其对基础生物医学研究和临床应用的影响和衍生可能是巨大的。
图10包括通过将空间滤光器应用至常规流式细胞仪来呈现本技术的示例性成像流式细胞仪的设计和原理的图解和图像。为了说明的目的，假设在流动室中以速度“v”行进的细胞具有三个离散的荧光点，如图10中所示。例如，任何流式细胞仪的光学设计可以被认为是将荧光发射(在二向色镜和其它光学组件之后)投射到光电倍增管(pmt)上的聚焦系统。在此处，可以将空间滤光器放置在pmt前面的图像平面处，如图10的图块a示出的。然后，利用通过光学器件确定的放大因数(例如，50×的放大因数)在空间滤光器的平面上形成细胞的荧光图像。当细胞以速度“v”在通道中行进时，投影到空间滤光器上的图像以mv的有效速度行进，其中m是放大因数。例如，将空间滤光器设计为使得细胞的不同部分将在不同时间通过不同狭缝(例如，相对于图10中示出的示例性空间滤光器，首先是上部，然后是中部，最后是底部)。因此，来自pmt的荧光信号的波形包括在时域中分离的模式序列，其中信号的每个部分与细胞的对应状态的荧光相关。图10中示出的表还显示，该特定实例中的强度分布如何与波形中的特征时间相关。在更一般的情况下，例如，可以通过取波形的时间导数来获得对应于每个狭缝的荧光强度分布。例如，图10的图块a中的示意图示出，使用本公开技术的示例性空间滤光器和例如可以在常规流式细胞仪中发现的pmt来重构行进细胞的荧光图像。在图块a的左边，细胞进入检测区并在此被激光照射而发射荧光。发射光通过模式化滤光器并随着时间的推移产生来自pmt的相应的电压变化。因为滤光器的模式为已知的，当细胞的特定特征通过滤光器并产生pmt电压变化时，数据处理单元实施图像数据处理方法(例如，利用基于滤光器特性的算法)以产生图像数据，并且在一些实施方式中，以重构图像。图10的图块a还显示，使用本公开技术的基于示例性空间滤光器设计的数据处理方法的包含原始荧光标记的细胞(左)和重构细胞图像(右)的图像。
例如，可以基于以下实例进行空间滤光器图像重构。在每个狭缝区上的荧光分布被复原之后，可以通过将所有荧光分布拼接在一起来构建整个细胞的荧光图像。复原图像的空间分辨率取决于例如狭缝的数目、每个狭缝的宽度和/或光学器件。可以实现在单数(singular)微米中(例如，2μm或更少)的空间分辨率，其适用于大多数应用。注意，在基于流式细胞仪系统的因素的一些实施方式中，空间滤光器设计可限制装置通量和灵敏度，因为滤光器在细胞流动方向上的总长度需要在降低的样品密度下操作以保持重合事件的频率较低。当第一个细胞离开滤光器区域之前，第二个细胞进入该区域，就发生重合事件。在一些实施方式中，对应于长滤光器的延长的激发区域，也可能降低荧光强度并影响系统的灵敏度。因此，空间滤光器设计可以包括空间频率滤光器。
图11的图块a显示使用空间频率滤光器来复原细胞荧光图像的另一示例性设计。该空间频率滤光器包括平行的狭缝阵列，并且每个狭缝具有唯一值周期性的周期性结构。当细胞行进通过滤光器状态时，荧光分布被显示为搭载于特征性载波频率上的卷积调幅信号。以这种方式，由细胞的每个荧光状态产生的信号通过特定的载波频率编码。在解调之后，可以获得细胞的荧光强度分布。图11的图块b显示从频率滤光器之后的信号复原的细胞图像，其中10个载波频率已经被用于将细胞切成10行。注意，例如，虽然图像质量受到不同频率组件间的串扰和检测器的带宽的限制，但可以解析细胞内的局部荧光特征。
图12显示可以并入具有最大兼容性的常规流式细胞仪中的多路复用空间频率滤光器的示例性设计。图12中示出的示例性滤光器设计包括三列狭缝，并且每列狭缝具有限定四个载波频率的四个周期性结构(包括通过打开的狭缝限定的基带)。在图12的该实例中，检测到的pmt波形相当于图10和图11中波形的叠加。例如，在时域和频域解调之后，可以获得整个细胞的荧光分布。与纯的空间滤光器方法相比，实现相同图像分辨率所需的滤光器的长度减少4×。因此，激光激发区和荧光收集区的长度从240μm降低至60μm。这与常规流式细胞仪的光学设计兼容(例如，具有60μmx20μm的光束斑，其中沿流动方向为60μm)。例如，仅使用三种不同的频率(不包括基带(例如，零频率))，因此与频率滤光器设计相比，pmt的采样率和带宽大大降低。
实施例
以下实施例示出了本技术的数个实施方案。可以在以下列出的实施例之前或者以下列出的实施例之后，呈现本技术的其它示例性实施方案。
在本技术的实施例(实例1)中，用于在流式细胞术中使颗粒成像的方法包括：在携带含有颗粒的流体样品的流体通道传输光束，使得所述光束被所述颗粒散射或引起来自所述流体通道中所述颗粒的荧光发射；在空间滤光器接收散射或荧光发射的光，所述空间滤光器包括具有多个孔的表面，所述孔以沿着与颗粒流相反的横向方向和与颗粒流平行的纵向方向的模式布置，使得流经所述模式的孔的颗粒的不同部分在不同时间通过不同的孔，并在与所述孔相关的位置散射光束或发射荧光；基于来自所述携带流体样品的流体通道的至少一些所接收的散射的光或发射的荧光，编码包括所述颗粒的时空信息的光信号；通过光检测器检测编码的光信号；以及在与所述光检测器通信的数据处理单元处理检测到的光信号，以产生与流过所述流体通道的颗粒相关的图像数据，其中所产生的图像数据包括所述颗粒的物理特征的信息。
实例2包括实例1所述的方法，其还包括基于所产生的图像数据形成所述颗粒的图像，其中所述图像包括所述颗粒的物理特征的视觉呈现。
实例3包括实例1所述的方法，其中当所述颗粒在所述流体通道中流动时，处理所述检测到的光信号是实时的。
实例4包括实例1所述的方法，其中处理所述检测到的光信号包括：在至少两个维度上确定所述颗粒的位置或速度；确定所述空间滤光器的特征函数，所述特征函数包括与所述模式的孔的尺寸和布置相关的参数；以及通过用确定的特征函数对颗粒信号进行去卷积，来确定与所述颗粒的一个或多个部分相关的局部信号以产生与所述颗粒相关的所述图像数据，其中所述颗粒信号包括所检测到的光信号、所确定的位置或速度、在所述空间滤光器聚焦所接收的散射的光或荧光发射的光的光学系统的放大倍数。
实例5包括实例1所述的方法，其还包括基于所述颗粒的确定的物理特征分选所述颗粒。
实例6包括实例1所述的方法，其中所产生的图像数据中所述颗粒的物理特征包括以下中的至少一种：所述颗粒的尺寸、所述颗粒的空间特征或几何形状、或所述颗粒的内部特征的位置或浓度。
实例7包括实例1或6所述的方法，其中所述颗粒包括生物细胞。
实例8包括实例7所述的方法，其中所产生的图像数据包括所述生物细胞中的内部细胞器、细胞核或寄生物质的荧光模式的空间分布数据。
实例9包括实例1所述的方法，其中所产生的图像数据包括由于所述颗粒的形状和密度分布引起的所述颗粒的散射模式数据。
实例10包括实例1所述的方法，其中所述孔的模式包括两个或更多个分开放置的狭缝，使得相邻的狭缝位于狭缝的在所述流体通道中颗粒流的纵向方向(y-方向)和与所述纵向方向垂直的横向方向(x-方向)的覆盖区之外。
实例11包括实例10所述的方法，其中所述孔的模式包括10个100μmx1mm的狭缝。
实例12包括实例1所述的方法，其中所述孔的模式包括狭缝组，其中每组狭缝包括两个或更多个平行的狭缝阵列，其在所述流体通道中颗粒流的纵向方向(y-方向)为移动的、空间分开的和非重叠的。
实例13包括实例1所述的方法，其还包括通过位于所述光路和所述光检测器的成像平面中的第二滤光器来编码所述光信号中的频率信息，所述第二滤光器包括频率调制孔的模式，所述频率调制孔包括具有存在间隔的平行的狭缝阵列的两组或更多组狭缝，以便相对于各组产生不同的周期。
实例14包括实例1所述的方法，其中所述光束包括激光束。
实例15包括实例1所述的方法，其中所述光检测器包括一个或多个光电倍增管(pmt)。
在本技术的实例(实例16)中，成像流式细胞仪系统包括：流体装置，其被构造成包括基板和设置在所述基板上的流体通道，以沿着颗粒流方向携带含有颗粒的流体样品；光源，其用于在所述流体通道产生光束以照射所述流体样品，其中当被所述光束照射时，光被所述颗粒散射或引起来自所述颗粒的荧光发射；光检测器，其被布置在散射或荧光发射的光的光路中；滤光器，其位于所述光检测器的成像平面并且被构造成包括具有多个孔的表面，所述孔以沿着与所述颗粒流方向相反的横向方向和与所述颗粒流方向平行的纵向方向的模式布置，使得流经所述模式的孔的颗粒的不同部分在不同时间通过不同的孔，并在与所述孔相关的位置散射光束或发射荧光，其中所述滤光器可操作以基于来自所述携带流体样品的流体通道的至少一些所接收的散射的光或发射的荧光，编码包括所述颗粒的时空信息的光信号，使得编码的光信号通过所述光检测器被检测到；和与所述光检测器通信的数据处理单元，所述数据处理单元处理所述编码的光信号，以产生与流过所述流体通道的颗粒相关的图像数据，其中所产生的图像数据包括所述颗粒的物理特征的信息。
实例17包括实例16所述的系统，其中所述数据处理单元被配置成处理所产生的图像数据以生成所述颗粒的图像，其中所述图像包括所述颗粒的物理特征的视觉呈现。
实例18包括实例16所述的系统，在所述数据处理单元被配置成通过以下来处理所述编码的光信号以产生所述图像数据：在至少两个维度上确定所述颗粒的位置或速度；确定所述滤光器的特征函数，所述特征函数包括与所述模式的孔的尺寸和布置相关的参数；以及通过用确定的特征函数对颗粒信号进行去卷积，来确定与所述颗粒的一个或多个部分相关的局部信号以产生与所述颗粒相关的所述图像数据，其中所述颗粒信号包括所检测到的光信号、所确定的位置或速度、在所述空间滤光器聚焦所接收的散射的光或荧光发射的光的光学系统的放大倍数。
实例19包括实例16所述的系统，其中所述系统可操作以基于所述颗粒的确定的物理特征分选所述颗粒，其中所述流体装置包括在所述流体通道的第一区域之后的所述流体通道的第二区域处的致动器，其中所述光束被照射时，与所述数据处理单元通信的所述致动器接收命令来根据所确定的物理特征分选所述颗粒。
实例20包括实例16所述的系统，其中所产生的图像数据中所述颗粒的物理特征包括以下中的至少一种：所述颗粒的尺寸、所述颗粒的空间特征或几何形状、或所述颗粒的内部特征的位置或浓度。
实例21包括实例16或20所述的系统，其中所述颗粒包括生物细胞。
实例22包括实例21所述的系统，其中所述生物细胞的内部特征包括所述细胞的细胞器或非天然物质。
实例23包括实例16所述的系统，其中所述数据处理单元包括输入/输出单元，其可操作以与外部计算机系统对接，从而向所述外部计算机系统提供所产生的图像数据并接收来自所述外部计算机系统的数据。
实例24包括实例16所述的系统，其中所述数据处理单元驻留在外部计算机系统上。
实例25包括实例24所述的系统，其中所述外部计算机系统包括个人计算机、平板电脑、智能手机或可佩戴通信装置。
实例26包括实例16所述的系统，其中所述滤光器的孔的模式包括两个或更多个分开放置的狭缝，使得相邻的狭缝位于狭缝的在所述流体通道中颗粒流的纵向方向(y-方向)和与所述纵向方向垂直的横向方向(x-方向)的覆盖区之外。
实例27包括实例26所述的系统，其中所述孔的模式包括10个100umx1mm的狭缝。
实例28包括实例16所述的系统，其中所述滤光器的孔的模式包括狭缝组，其中每组狭缝包括两个或更多个平行的狭缝阵列，其在所述流体通道中颗粒流的纵向方向(y-方向)为移动的、空间分开的和非重叠的。
实例29包括实例16所述的系统，其还包括位于所述光路和所述光检测器的成像平面中的第二滤光器，所述第二滤光器包括频率调制孔的模式，所述频率调制孔包括具有存在间隔的平行的狭缝阵列的两组或更多组狭缝，以便相对于各组产生不同的周期。
实例30包括实例16所述的系统，其中所述光源包括激光，并且所述光束包括激光束。
实例31包括实例16所述的系统，其中所述光检测器包括一个或多个光电倍增管(pmt)。
在本技术的实例(实例32)中，用于编码来自在流体通道中流动的颗粒的光信号的空间滤光器包括具有多个孔的基板，所述孔以沿着与在所述流体通道中流动的颗粒的颗粒流方向相反的横向方向和与在所述流体通道中流动的所述颗粒的颗粒流方向平行的纵向方向的模式布置，其中所述空间滤光器可操作以便当位于光束照射的所述流体通道的照射区域与光检测器之间的光路时，编码来自在所述流体通道中流动的颗粒的光信号，其中所述空间滤光器位于所述光检测器的成像平面，其中所述空间滤光器可操作以便基于流经所述模式的孔的颗粒的不同部分在不同时间通过不同的孔，并在与所述孔相关的位置散射光束或发射荧光，来编码所述光信号，其中基于来自所述流体通道的至少一些所接收的散射的光或发射的荧光，所述编码的光信号包括所述颗粒的时空信息。
实例33包括实例32所述的空间滤光器，其中由所述滤光器编码的所述光信号的时空信息，提供包括所述颗粒的物理特征的数据，其能够被处理以产生与流过所述流体通道的颗粒相关的图像数据，其中所述图像数据通过以下来产生：在至少两个维度上确定所述颗粒的位置或速度；确定所述空间滤光器的特征函数，所述特征函数包括与所述模式的孔的尺寸和布置相关的参数；以及通过用确定的特征函数对颗粒信号进行去卷积，来确定与所述颗粒的一个或多个部分相关的局部信号以产生与所述颗粒相关的所述图像数据，其中所述颗粒信号包括所检测到的光信号、所确定的位置或速度、在所述空间滤光器聚焦所接收的散射的光或荧光发射的光的光学系统的放大倍数。
实例34包括实例32所述的空间滤光器，其中所述孔的模式包括两个或更多个分开放置的狭缝，使得相邻的狭缝位于狭缝的在所述流体通道中颗粒流的纵向方向(y-方向)和与所述纵向方向垂直的横向方向(x-方向)的覆盖区之外。
实例35包括实例34所述的空间滤光器，其中所述孔的模式包括10个100μmx1mm的狭缝。
实例36包括实例32所述的空间滤光器，其中所述滤光器的孔的模式包括两组或更多组狭缝，其中每组狭缝包括两个或更多个平行的狭缝阵列，其在所述流体通道中颗粒流的纵向方向(y-方向)为移动的、空间分开的和非重叠的。
实例37包括实例36所述的空间滤光器，其中所述空间滤光器还包括位于所述光路和所述光检测器的成像平面中的第二滤光器，所述第二滤光器包括频率调制孔的模式，所述频率调制孔包括具有存在间隔的平行的狭缝阵列的两组或更多组狭缝，以便相对于各组产生不同的周期。
实例38包括实例37所述的空间滤光器，其中所述第二滤光器包括三个组，其中第一组的狭缝以第一周期间隔开，第二组的狭缝以第一周期的倍数间隔开，以及第三组的狭缝以第一或第二周期的倍数间隔开。
在本技术的实例中(实例p1)，在流式细胞仪中使颗粒成像的方法包括：传输光束通过空间布置在流体通道附近的孔的模式，以照射含有颗粒的流体样品，其中所述孔的模式包括基板，其被构造成形成布置在所述基板上的多个狭缝，使得流过所述孔的模式的颗粒的不同部分在不同时间通过不同的狭缝，并使所述光束散射以产生光散射信号；通过光检测器检测至少一些光散射信号；以及基于光散射信号来编码包含所述颗粒的时空信息的波形。
实例p2包括实例p1所述的方法，其中所述孔的模式包括两个或更多个分开放置的狭缝，使得相邻的狭缝位于狭缝的在所述流体通道中颗粒流的纵向方向(y-方向)和与所述纵向方向垂直的横向方向(x-方向)的覆盖区之外。
实例p3包括实例p3所述的方法，其中所述孔的模式包括10个100μmx1mm的狭缝。
实例p4包括实例p1所述的方法，其中所述孔的模式包括狭缝组，其中每组狭缝包括三个平行的狭缝阵列，其在所述流体通道中颗粒流的纵向方向(y-方向)为移动的、空间分开的和非重叠的。
实例p5包括实例p1所述的方法，其中所述光束包括激光束。
实例p6包括实例p1所述的方法，其中所述光检测器包括一个或多个光电倍增管(pmt)。
实例p2包括实例p1所述的方法，其还包括处理所述编码的波形以确定所述颗粒的物理特征；以及形成包括所述物理特征在内的所述颗粒的图像。
实例p7包括实例p1所述的方法，其中所述颗粒包括细胞。
本专利文件中描述的主题和功能操作的实现可以在各种系统、数字电子电路、或计算机软件、固件或硬件中实施，包括本说明书中公开的结构及其结构等同物，或它们中的一种或多种的组合。本说明书中描述的主题的实现可以以一种或多种计算机程序产品实施，所述计算机程序产品即在有形和非暂时性计算机可读介质上编码的计算机程序指令的一个或多个模块，用于通过数据处理设备执行或来控制数据处理设备的操作。计算机可读介质可以为机器可读存储装置、机器可读存储基板、存储装置、影响机器可读传播信号的物质组成或它们中的一种或多种的组合。术语“数据处理设备”涵盖用于处理数据的所有设备、装置和机器，其包括例如可编程处理器、计算机或多个处理器或计算机。除了硬件之外，设备可以包括为讨论中的计算机程序创建执行环境的代码，例如，构成以下的代码：处理器固件、协议栈、数据库管理系统、操作系统或它们中的一种或多种的组合。
计算机程序(也被称为程序、软件、软件应用、脚本或代码)可以以任何形式的编程语言编写，所述编程语言包括编译或解释语言，并且可以以任何形式部署，包括作为独立程序或作为模块、组件、子程序或适用于计算环境中的其它单元。计算机程序不一定对应于文件系统中的文件。程序可以存储在保存其它程序或数据(例如，在标记语言文件中存储的一个或多个脚本)的文件的一部分中，存储在专用于所讨论的程序中的单个文件中，或存储在多个协调文件(例如，存储一个或多个模块、子程序或部分代码的文件)中。可以将计算机程序部署为在一个或多个计算机上执行，所述计算机位于一个地点或分布在多个地点，并且通过通信网络互连。
本说明书中描述的过程和逻辑流程可以由执行一个或多个计算机程序的一个或多个可编程处理器进行，以通过对输入数据进行操作并生成输出来执行功能。该过程和逻辑流程也可以通过专用逻辑电路，例如，fpga(现场可编程门阵列)或asic(专用集成电路)执行，并且设备也可以以专用逻辑电路，例如，fpga(现场可编程门阵列)或asic(专用集成电路)实施。
适用于执行计算机程序的处理器包括例如通用和专用微处理器两者，以及任何种类的数字计算机的任何一个或多个处理器。通常，处理器从只读存储器或随机存取存储器或两者接收指令和数据。计算机的基本元件为用于执行指令的处理器和一个或多个用于存储指令和数据的存储装置。通常，计算机也包括，一个或多个用于存储数据的大容量存储装置(例如，磁盘、磁光盘或光盘)，或可操作地耦合以从一个或多个用于存储数据的大容量存储装置(例如，磁盘、磁光盘或光盘)接收数据或向其传输数据或两者。然而，计算机本来不需要这样的装置。适用于存储计算机程序指令和数据的计算机可读介质，包括所有形式的非易失性存储器、介质和存储装置，其包括例如半导体存储装置，例如，eprom、eeprom和闪存装置。处理器和存储器可以由专用逻辑电路补充，或并入其中。
预期说明书中所述的实施方案和实施方式以及附图被认为是示例性的，其中“示例性的”意为一个实例。如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指明。另外，“或者”的使用可以包括“和/或”，除非上下文另有明确指明。
虽然本专利文件含有许多细节，但这些不应被解释为对任何发明范围的限制或对所要求保护的范围的限制，而是针对特定发明的具体实施方案的特征的描述。在单独实施方案的上下文中，在本专利文件中描述的某些特征也可以在单个实施方案中组合实施。相反地，在单个实施方案的上下文中描述的多种特征，也可以在多个实施方案中分开实施，或者以任何合适的子组合实施。此外，虽然上文将特征描述成以某些组合起作用，且甚至最初这样要求，但来自要求保护的组合的一个或多个特征可以在一些情况中从组合中脱离，并且要求保护的组合可以针对子组合或子组合的变型。
类似地，当附图中以特定次序描绘操作时，这不应被理解为需要以所示的特定次序或按依次顺序来实施所述操作，或实施全部示出的操作来达到期望结果。此外，本专利文件中描述的实施方案中的各种系统组件的分离，不应被理解为在所有实施方案中均要求这样的分离。
仅描述了一些实施方式和实施例，并且可以基于本专利文件中描述和示出的，可以进行其它实施方式、改进和变型。
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