包含氯离子和硫酸根离子的苏木精溶液及制备和使用方法与流程

本发明涉及用于生物样品的组织化学染色的组合物和方法。更具体地，本发明涉及具有增强的降解稳定性的苏木精(hematoxylin)制剂。

背景技术：

苏木精已经被描述为组织学、组织化学、组织病理学和细胞学中最重要和最常用的染料。几种组织化学染色方案(包括苏木精和伊红(h&e)染色以及巴氏(papanicolaou,pap)染色)均依赖于染料苏木精来染色细胞学和组织样品。具体地，病理学家使用细胞核的苏木精染色来检测肿瘤活检样品中恶性和/或转移性细胞的存在。苏木精，也称为苏木素(haematoxylin)、自然黑1(naturalblack1)或c.i.75290m，是在洋苏木(hematoxylon)属的树(例如洋苏木树)的红色心材中发现的天然存在的化合物。苏木精不是染色组织组分的活性成分。相反，苏木精的氧化产物，即苏木因(hematein)成为苏木精染料溶液的活性染色组分，特别是在与媒染剂(mordant)复合时。苏木因-媒染剂复合物与含有负电荷的化合物结合，并将它们染成深蓝色或紫色，这使得病理学家可以观察生物样品中的这些含负电荷的结构。

埃利希苏木精(ehrlich'shematoxylin)是广泛使用的苏木精制剂，因为它用于染色蓝色、粉红色和红色的组织色调。埃利希苏木精的制剂包含：100ml水、100ml乙醇(100％)、100ml甘油、10ml冰醋酸、2g苏木精和基于溶解度过量的硫酸铝钾(明矾；alk[so4]2·12h2o)。为了制备埃利希苏木精，将组分混合并使其成熟大约一个月。取决于制剂，涉及暴露于空气和阳光的成熟过程可能需要3个月或更多个月以提供适合染色细胞的溶液。该过程可能是高度可变的，并且通常不能充分可重复地制造苏木精以用于临床自动染色器。

为了加速苏木精向苏木因的转化，可以使用化学氧化剂。不幸的是，加速过程通常会产生无效的反应产物例如氧化苏木因(oxyhematein)和复合的聚合沉淀物，并且还提供比自然成熟的染料溶液更快降解的溶液。将苏木精定量氧化成苏木因所需的氧化剂的精确量可用于帮助避免过度氧化成无效产物，但当不立即进行染色时，更通常使用部分氧化的溶液。在部分氧化的溶液中，在化学氧化步骤后残留的苏木精的自然氧化将继续取代任何在染色期间消耗的或者被进一步自然氧化成无效产物的苏木因。此外，苏木因的浓度(和量)可能随时间而变化。

由于苏木因是苏木精溶液的活性染色组分，随着时间的推移，其浓度(和/或其媒染剂复合物的浓度)的变化导致染色不一致。

苏木精已被称为组织和细胞的染色剂达至少一个世纪；然而，与自动染色器相容的制剂只是初步发现。手动染色通常涉及将置于载玻片的样品浸入(dunking)或沉入(dipping)到含有苏木精制剂的容器中。该操作的第一个优点是大的沉淀物落入瓶内以使其不会沉积在载玻片上。在手动染色操作中，可以通过基于目视检查改变生物样品与溶液的接触时间来补偿苏木精溶液的苏木因含量的变化。例如，可以将明显染色不足的样品简单地放回苏木精溶液中一段时间以增加染色强度。然而，在自动化染色操作中，“目视”检查和响应于染色不足的延长曝光时间可能需要昂贵的成像设备并且可能破坏其它样品的处理。尽管手动苏木精染色有一些实际的优点，但患者安全性问题、可重复性和速度/成本已经引起了采用自动化苏木精染色的激增。患者安全问题在于，样品可以并且确实在染色浴中失去对其载玻片的粘附。然后将这些外来样品转移到同时或稍后染色的载玻片上，这可能导致误诊。该问题的解决方案是提供一次性染色试剂作为载玻片表面上的槽(puddle)，由此不可能发生交叉污染。该载玻片上(on-slide)方法需要基本上不同的染色制剂，因为通过自动染色器将试剂递送到载玻片采用了必须不接触沉淀物的仪器管道。此外，苏木精溶液应具有延长的贮存期以用于商业应用。最后，对于高容量自动染色器，溶液可能只有5分钟或更短，通常2分钟或更短，来染色样品。因此，苏木精自动染色溶液具有独特的要求，该要求对于适用于手动染色的制剂而言是无法满足的。

发明概述

本公开描述了新的苏木精染色组合物和使用该组合物染色组织的更有效的方法。本公开的一个方面是，尽管有许多最近的进展，但防止苏木精溶液中的沉淀物产生同时改善长期染色质量仍然是该领域的持续挑战。本公开的另一方面是，使用化学添加剂或增加苏木精稳定性的任何成分应该是无毒的、环境友好的和成本相对较低的。因此，本公开的一个方面是不含有毒的、对环境有害的和相对昂贵的成分的组合物。不依赖于化学添加剂来降低沉淀物形成的速率，本公开描述了制备具有确定的抗衡离子比例的苏木精溶液的优异结果。根据另一方面，认为硫酸根离子作为抗衡离子是有利于沉淀物形成的可能因素，并且发现包含氯离子作为抗衡离子是该问题的可能的解决方案。具体地，发现特定的氯离子/硫酸根离子比例(即cl^-/so4^2-摩尔比)作为染色制剂是特别有利的。

传统上几乎所有的苏木精制剂中都使用硫酸铝，最有可能是因为由此制备的溶液在相对短的时间内产生强烈的核染色方面是优异的。本公开的一个方面是，虽然已知基于硫酸铝和氯化铝的苏木精溶液，但本文公开的实施例证明使用单独的氯化铝或单独的硫酸铝制备的苏木精溶液比包括各比例的二者的组合物差。具体地，当使用氯化铝作为硫酸铝的替代物时，与硫酸铝制剂相比，苏木精需要多得多的时间来实现相似的染色特性。尽管发现这些氯化铝溶液对形成沉淀物更具抗性，但染色特性是不可接受的慢。虽然不限于特定的理论，但应理解实现这一效果的机制与和硫酸根离子相比，氯离子对铝的结合亲和力更大相关。发现更高的亲和力(更多的共价特征或更强的)铝-氯离子键以与增加所有苏木精溶液的溶液ph相同的方式影响苏木精明矾(hemalum)色调。还确定染色色调受氯离子含量的影响。更多的氯离子驱动染色色调从红色向蓝色。在仅硫酸根离子的制剂中，随着ph下降(甚至在窄ph范围内(例如2.45-2.59))，苏木精色调偏移到红色。换句话说，较低ph的基于氯离子的制剂的色调将与较高ph的传统硫酸根离子溶液相似，并且较低的ph值有利于苏木精明矾溶解度。应理解的是，存在氯离子“阻断”作用，如图1(c)所示，其与处于氯离子允许的较低工作ph值的质子浓度增加一起起作用，用于干扰另外发生在单个苏木精明矾分子之间的相互作用，进而不利于沉淀。不幸的是，虽然氯离子的存在(或其在较低ph值允许的功能性染色)破坏了沉淀物的形成，但它也导致了较低的染色速率，因为它也必须干扰苏木精明矾和组织之间所需的相互作用。

然而，通过仔细的实验，发现在苏木精制剂中硫酸铝和氯化铝的组合可以产生如硫酸根离子溶液那样快速和强烈地染色的溶液，但是对沉淀的抗性强得多。此外，实施例表明，由氯离子提供的稳定性增强通常超过使用已知的化学添加剂(例如主体化合物和抗氧化剂)所赋予的益处。尽管仍然可以包括这些添加剂，但当使用本文公开的硫酸根离子/氯离子比例时，它们的包含是不必要的。在又一方面，本公开显示，可以使用无毒的(或非危险的)丙二醇代替目前描述的苏木精制剂中的乙二醇或乙醇(一些机构将其分类为有毒/有害的成分)。

附图简述

图1(a-c)是化学结构，其显示：(a)苏木精明矾复合物，其中铝被苏木因和两种水性物质复合，其对于al2(so4)3·nh2o用作媒染剂的苏木精溶液将是存在的；(b)显示提出的苏木精沉淀物结构的苏木精明矾低聚物，其中多种(n)苏木因复合物形成内部铝物质被两种苏木因物质复合的链；和(c)苏木精明矾复合物，其中铝被苏木因、一种水性物质和一种氯离子物质复合，其对于alcl3·6h2o至少部分地用作媒染剂的苏木精溶液将是存在的。

图2(a-f)是用以下溶液染色的在10×放大倍数取出的4微米厚组织切片的连续切片的显微照片：(a)新鲜制备的实施例1的苏木精溶液、(b)新鲜制备的实施例4的苏木精溶液、(c)如实施例9所述经过加速老化(45℃，32天)的实施例1的苏木精溶液和(d)如实施例9所述经过加速老化(45℃，32天)的实施例4的苏木精溶液；图2(e)和图2(f)是图2(c)和图2(d)所示的相同切片，分别用更近的视角(例如数字变焦)示出。

图3(a-b)是显示苏木精溶液在其接触表面上的沉淀的照片。图3(a)显示在瓶被排干并用去离子水(di水)淋洗之后，已预先在45℃含有苏木精32天的两个瓶(聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneterephthalateglycol)改性的)，左图显示含有如实施例1所述的制剂的瓶，右图显示含有实施例4的制剂的瓶。图3(b)显示所述管路被排干并用di水淋洗，在60℃含有溶液7天之后，将在自动染色器中发现类似于这种类型(例如全氟烷氧基树脂(pfa))的管路。左管含有如实施例1所述的制剂，右管含有如实施例4所述的制剂。

图4(a-b)是用以下溶液染色的4微米厚组织切片的连续切片的显微照片：(a)如实施例9所述经过加速老化(45℃，32天)的实施例1的苏木精溶液；和(b)如实施例9所述经过加速老化(45℃，32天)的实施例4的苏木精溶液，其中可以进一步描述如本文所述的良好染色性能和不良染色性能之间的差异。

具体实施方式

i.术语：

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。

单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地指出。因此，例如，提及“主体化合物”是指一种或多种主体化合物，例如2种或更多种主体化合物、3种或更多种主体化合物或甚至4种或更多种主体化合物。

术语“抗氧化剂”是指具有比第二个原子或分子更大的氧化电位的原子或分子，使得抗氧化剂优先被氧化而不是第二个原子或分子。例如，抗氧化剂可以具有比苏木因更大的氧化电位，因此有助于防止苏木因氧化成氧化苏木因。此外，抗氧化剂还可以用作还原剂，例如，将氧化苏木因转化回苏木因的还原剂。

术语“水性溶剂”是指具有水作为主要组分并且在室温为液体的组合物。具有50体积％或以上含水量的水和一种或多种低级烷醇或多元醇的混合物是水性溶剂的实例。例如，乙二醇或丙二醇和水的溶液是水性溶剂。

术语“生物样品”是指任何从生物实体例如动物获得或以其它方式衍生的样品，例如，从人或兽医动物例如犬、猫、马或牛获得的样品。生物样品的实例包括细胞学样品、组织样品和生物流体。生物样品的非限制性的具体实例包括血液、尿液、射精前液(pre-ejaculate)、乳头吸出液、精液、乳液、痰、粘液、胸膜液、骨盆液、滑液(sinovialfluid)、腹水、体腔清洗液、眼刷洗物、皮肤碎屑、口腔拭样、阴道拭样、巴氏涂片、直肠拭样、吸出物、针活检、组织切片(例如通过手术或验尸获得的)、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、汗液、泪液、唾液、肿瘤、获自体外细胞或组织培养的器官和样品。通常，样品将是已经固定、加工以除去水并包埋在石蜡或另一种适用于切割成组织切片的蜡状物质中的活检样品。生物样品可以安装在例如显微镜载玻片的基底上用于处理和/或检查。

本文所用的术语“苏木精组合物”一般是指通过将苏木因(苏木精的氧化产物)直接溶解到溶剂中形成的组合物和通过将苏木精溶解到溶剂中并允许或促进将苏木精氧化成苏木因而形成的组合物。虽然通过将苏木精溶解到溶剂中并通过与空气接触的天然氧化或加速的化学氧化将苏木精(完全地或部分地)转化成苏木因来制备所公开的组合物是更典型的，但所公开的组合物组分的稳定作用的益处也可以与通过将苏木因直接溶解到溶剂中制备的苏木因组合物组合使用。因此，在一些实施方案中，“苏木精组合物”将至少最初包括少量或不含苏木精，并且主要由苏木因组成。本文公开了各种组分的摩尔浓度。这些浓度被理解为反映了配制和制备时的浓度。根据各种平衡偏差反应，这些成分的浓度会随时间而变化。因此，浓度可以被描述为配制或制造。这种方法被理解为描述本文所述的解决方案的最清楚和准确的方式，因为它们倾向于随着时间的推移而成熟。

术语“主体化合物”是指具有内腔部分或凹槽(groove)部分的有机或无机分子、复合物或材料，更具体地，是指具有内腔部分或凹槽部分的分子，其可以容纳半乳糖或其它染料分子的至少一部分。主体化合物包括多糖例如直链淀粉，环糊精和其它含有多个醛糖环的环状或螺旋状化合物，例如通过单糖(例如葡萄糖、果糖和半乳糖)和二糖(例如蔗糖、麦芽糖和乳糖)的1,4和1,6键合形成的化合物。其它主体化合物包括穴醚(cryptand)、穴番(cryptophane)、穴状配体(cavitand)、冠醚、树枝状大分子、纳米管、杯芳烃、缬氨霉素和尼日利亚菌素(nigericin)。在具体实施方案中，主体化合物可以是环糊精或环糊精衍生物。美国专利8,551,731广泛地公开了主体化合物及其在稳定苏木精溶液中的用途，其通过引用整体并入本文以用于涉及稳定的苏木精溶液的公开。虽然主体化合物在稳定苏木精溶液方面是有效的，但它们往往是昂贵的，并且沉淀仍然是一个问题。在本文所示的实施例中，根据美国专利8,551,731中公开的方法制备对照组合物(称为ans苏木精)，因为它们代表目前已知的最知名的自动化苏木精制剂。

主体化合物可以包括用一个或多个取代基修饰的环糊精衍生物、直链淀粉衍生物、穴醚衍生物、穴番衍生物、穴状配体衍生物、冠醚衍生物、树枝状大分子衍生物、纳米管衍生物、杯芳烃衍生物、缬氨霉素衍生物和尼日利亚菌素衍生物。例如，主体化合物包括直链淀粉衍生物和环糊精衍生物，其中一个或多个羟基或其组成醛糖环的羟基的氢原子被取代基取代。取代基的实例包括酰基(例如乙酰基)、烷基、芳基、甲苯磺酰基、甲磺酰基、氨基(包括伯、仲、叔和季氨基)、卤代基团(-f、-cl、-br和-i)、硝基、含磷基团(例如磷酸盐和烷基磷酸酯基)、含硫基团(例如硫酸盐和硫酸酯基团)、桥连基团(例如，其连接环糊精环上的两个或更多个羟基或连接两个或更多个主体化合物)、醛基、酮基、肟基、羧酸基及其衍生物、碳酸酯和氨基甲酸酯基、含硅基团、含硼基团、含锡基团和羟烷基(例如羟乙基和羟丙基)。

环糊精的具体实例包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精和δ-环糊精，以及这些类型的环糊精的每一种的衍生物。环糊精衍生物的具体实例包括羟丙基化α-环糊精、羟丙基化β-环糊精、羟丙基化γ-环糊精、羟乙基化α-环糊精、羟乙基化β-环糊精、羟乙基化γ-环糊精、羟基异丙基化α-环糊精、羟基异丙基化β-环糊精、羟基异丙基化γ-环糊精、羧甲基化α-环糊精、羧甲基化β-环糊精、羧甲基化γ-环糊精、羧乙基化α-环糊精、羧乙基化β-环糊精、羧乙基化γ-环糊精、辛基琥珀酰化-α-环糊精、辛基琥珀酰化-β-环糊精、辛基琥珀酰化-γ-环糊精、乙酰化-α-环糊精、乙酰化-β-环糊精、乙酰化-γ-环糊精、硫酸化-α-环糊精、硫酸化-β-环糊精和硫酸化-γ-环糊精。环糊精衍生物的其它具体实例包括以下β-环糊精衍生物：2,3-二甲基-6-氨基甲基-β-环糊精、6-叠氮基-β-环糊精、6-溴-β-环糊精、6a,6b-二溴-β-环糊精、6a,6b-二碘-β-环糊精、6-o-麦芽糖基-β-环糊精、6-碘-β-环糊精、6-甲苯磺酰基-β-环糊精、过乙酰基-麦芽糖基-β-环糊精、6-叔丁基二甲基甲硅烷基-β-环糊精、2,3-二乙酰基-6-丁基二甲基甲硅烷基-β-环糊精、2,6-二丁基-3-乙酰基-β-环糊精、2,6-二丁基-β-环糊精、2,6-叔丁基-二甲基甲硅烷基-β-环糊精和2,6-二-o-甲基-3-烯丙基-β-环糊精。各种环糊精和环糊精衍生物可以例如从ctd,inc.(highsprings,fla.)商购获得，或者它们可以根据科学文献中概述的操作合成，例如“chemistryofchemicallymodifiedcyclodextrin”，croftandbartsch，tetrahedron，39：1417-1474，1983。

术语“低级烷醇”是指具有式r-oh的化合物，其中r是具有1至5个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基或新戊基。低级烷醇的实例包括甲醇、乙醇和异丙醇。

术语“氧化剂”是指具有比第二个分子更大的还原电位，例如比苏木精具有更大的还原电位的原子或分子，使得其将与苏木精反应并将其氧化成苏木因。氧化剂包括扩散至苏木精并将其氧化的大气中天然存在的分子氧，以及与苏木精(通常在溶液中)活性组合以将至少一部分苏木精转化成苏木因的“化学氧化剂”。有用的化学氧化剂的实例包括碘酸盐(例如碘酸钠和碘酸钾)、氧化汞、高锰酸盐(例如高锰酸钾)、高碘酸盐(例如高碘酸钠和高碘酸钾)和过氧化物(例如过氧化氢)中的一种或多种。在具体实施方案中，化学氧化剂包含碘酸钠。

术语“媒染剂”是指一种离子金属物质，染料(例如苏木因)可以与其形成复合物(例如阳离子复合物)，该复合物用于将染料(例如苏木因)结合至特定的细胞组分例如核dna、髓磷脂、弹性和胶原纤维、肌横纹和线粒体。媒染剂的实例包括铝(例如，以明矾如硫酸铝、硫酸铝钾、硫酸铝铵或氯化铝的形式)、铁、钨、锆、铋、钼(磷钼酸或钼酸)、钒(钒酸盐)。

ii.概述

铝苏木精的溶液易于降解，随时间的变化形成越来越多的沉淀，其可以早在制剂制备之后几天在溶液中或载玻片上检测。图1(a)显示在酸性溶液中衍生自硫酸铝媒染剂的苏木精明矾的结构。铝通过所示的苏木因和水复合。图1(b)所示的是所提出的苏木精明矾沉淀物结构，其由苏木精明矾的聚集物(其活性物质中的带正电荷的染料物质)组成，其中n是大于1的整数。在染色的组织标本载玻片上，苏木精沉淀物可以表现出多种形态，范围从直径4-5微米的离散微晶不透明斑点到直径超过100微米的不透明片(例如不借助显微镜的帮助下明显的)。如图2所示，沉淀物倾向于在带负电的组织成分上聚积(即与其缔合)。理解为增加沉淀速率的因素包括：超过约2.3的ph值、升高的温度、冷冻/解冻循环、温度变化、高苏木精明矾浓度和延长时间。因此，已经使用保持低的ph、保持稳定的温度和降低苏木精浓度来降低沉淀速率。此外，最近描述了化学稳定化方法(参见美国专利8,551,731)。

在溶液本身中，沉淀物倾向于在空气/液体界面或表面/容器界面(例如在瓶或管的表面上)的界面处积聚。这可以在图3(a-b)中看出，图3(a-b)是显示苏木精溶液在其接触表面上的沉淀的照片。图3(a)显示在瓶被排干并用di淋洗之后，已预先在45℃含有苏木精32天的两个瓶(聚对苯二甲酸乙二醇酯改性的)，左图显示含有如实施例1所述的制剂的瓶，右图显示含有实施例4的制剂的瓶。图3(b)显示所述管路被排干并用di水淋洗，在60℃含有溶液7天后，将在自动染色器中发现类似于这种类型(例如pfa)的管路，左图显示含有如实施例1所述的制剂的管，右图显示含有实施例4的制剂的瓶。苏木精溶液倾向于在诸如产品包装的表面上沉淀，形成涂层，该涂层呈青铜色和/或具有金属光泽。沉淀物的积累最终导致溶液外观的巨大变化，并且用这些溶液可接受的染色变得不切实际。沉淀物的溶解和防止是可能的，例如通过酸化或螯合，但是这些方法不能直接应用于染料溶液，因为它们也不利地影响染色质量和染色剂的诊断效用。由于这些原因，当不能使用自然成熟时，苏木精溶液通常仅根据需要制备，并在使用后立即丢弃。

在需要更长的溶液寿命的情况下，例如在自动化染色平台上，已经开发了几种方法来降低沉淀物形成速率，同时保持长期染色特性。最常见地，苏木精溶液可以使用亚化学计量的氧化剂(通常为碘酸盐)来制备。这导致少于最初形成的总可能量的苏木精明矾，将未反应的染料前体留在溶液中。将剩余的苏木精缓慢“成熟”(空气氧化)为苏木因，实际上结合铝形成苏木精明矾染料的组分延迟沉淀的形成和积累，因为在任何给定时间溶液中存在较低浓度的苏木精明矾。将抗氧化剂包含在制剂(例如氢醌)中也可以延缓成熟过程，提供关于沉淀物形成的进一步的制剂稳定性。不常见的是，也可以引入化学添加剂例如β-环糊精来降低沉淀物形成速率。添加剂通过提供与聚合动力竞争的可逆化学途径起作用，从而降低沉淀速率。在β-环糊精的情况下，溶液中的苏木精明矾分子与添加剂形成弱复合物，降低了苏木精明矾分子将彼此形成复合物的可能性。不幸的是，热力学上有利的产物(沉淀物)最终将以与没有添加剂相同的量获得，但速率降低。

wadamatsukikuo最近在日本公开专利申请jp2014059282中公开了苏木精溶液的创新。该出版物的标题可以翻译为“抗微生物苏木精溶液和扩大的抗微生物苏木精溶液”，公开了据称显示抗微生物/抗真菌性质的苏木精溶液的制备。抗微生物苏木精的公开以某种方式是神秘的，因为苏木精组合物不被广泛地理解为对细菌或真菌敏感。所述溶液含有：氯化铝六水合物，5.0g；苏木精，1.5g；碘酸钠，0.3g；乙醇，30ml；水，870ml；甘油，100ml。除了碘酸盐的存在和成分的相对量以外，该配方非常类似于mayer'smucihematein，一种配制用于手工染色的苏木精溶液，其使用氯化铝作为媒染剂。其它常见的含氯化铝的制剂是rozas铁苏木精，其还含有硫酸铁铵作为共同媒染剂。

申请人参考mayer制剂，并特别指出的是使用氯化铝，因为它比硫酸铝钾(钾明矾)(一种典型的铝媒染剂)更容易(快速地)溶解。虽然没有明确公开为什么该制剂更具微生物/真菌抗性，但应理解为：(1)使用大量的碘酸盐(其在其它制剂中使用的量的上限)和(2)在制剂结束时加入碘酸盐-在大量过量的al(iii)已经在溶液中之后，降低溶液ph，从而增加碘酸盐的氧化电位。没有建议氯离子与微生物/真菌抗性相关。相反，碘酸盐是已知的防腐剂，并且高浓度自然会导致更好的杀生物性质。关于加入顺序，如碘酸盐(io3^-)氧化苏木精，形成碘化物(i^-)作为最终产物。一些碘化物将被剩余的碘酸盐氧化成元素碘(i2)。该方法似乎由溶液中过量的al(iii)催化。例如，我们自己的实验显示，当以所报告的相同顺序加入碘酸盐时，不可避免地形成显著量的碘，并且在容器中可以清楚地观察到。由于这对我们的制剂是不利的，我们制造苏木精的方法规定在加入任何铝之前氧化苏木精。

此外，jp2014059282公开了用氯离子制剂染色缓慢，并且这与我们的结果完全一致。为了抵抗这种缓慢的染色，jp2014059282公开了在加入苏木精和碘酸盐之前组合氯化铝和硫酸铝的溶液。该溶液在其中称为“延伸抗菌苏木精溶液”(eahs)。然而，所公开的组合物仍然对本文所公开的自动染色器方法染色组织太慢。本公开也没有表明cl^-/so4^2-摩尔比在约2.5/1和约1/2之间对于稳定性是重要的。

iii.苏木精组合物

在示例性实施方案中，苏木精染色组合物包含溶剂、苏木精、足以将至少一部分苏木精转化成苏木因的量的化学氧化剂、媒染剂，其中所述组合物具有约2.5/1至约1/4的氯离子/硫酸根离子(cl^-/so4^2-)摩尔比。在示例性实施方案中，苏木精组合物包括溶剂、苏木精、足以将至少一部分苏木精转化成苏木因的量的化学氧化剂、媒染剂，其中所述组合物进一步包含cl^-和so4^2-，其中所述cl^-/so4^2-摩尔比为约2.5/1至约1/4。在一个实施方案中，媒染剂包括al2(so4)3、al2(so4)3·16h2o、alm(so4)2·12(h2o)、al2(so4)3·6h2o、al2(so4)3·18h2o或[al(h2o)6]2(so4)3·5h2o，其中m是一价阳离子。一价阳离子的非限制性实例包括li⁺、na⁺、k⁺、cs⁺、nh4⁺等。

在一个实施方案中，媒染剂包括alcl3或alcl3·6h2o。在另一个实施方案中，媒染剂包括al2(so4)3、al2(so4)3·16h2o、alm(so4)2·12(h2o)、al2(so4)3·6h2o、al2(so4)3·18h2o、[al(h2o)6]2(so4)3·5h2o、alcl3或alcl3·6h2o，其中m是一价阳离子。在一个实施方案中，组合物具有约2/1至约1/2的cl^-/so4^2-摩尔比。在另一个实施方案中，组合物具有约1.5/1至约1/1.5的cl^-/so4^2-摩尔比。在又一个实施方案中，组合物具有约1/1的cl^-/so4^2-摩尔比。在一个实施方案中，化学氧化剂是碘酸钠。

在示例性实施方案中，将苏木精染色组合物制成约0.01m至约0.05m苏木精的摩尔浓度。在另一个实施方案中，将组合物制成约0.02m至约0.04m苏木精的摩尔浓度。在又一个实施方案中，将组合物制成约0.03m苏木精的摩尔浓度。在另一个实施方案中，将组合物制成约0.001m至约0.01m碘酸钠的摩尔浓度。在另一个实施方案中，将组合物制成约0.003m至约0.008m碘酸钠的摩尔浓度。在一个实施方案中，将组合物制成约0.005m碘酸钠的摩尔浓度。在另一个实施方案中，组合物为约0.1m铝。在另一个实施方案中，将组合物制成约0.1m铝的摩尔浓度。在又一个实施方案中，将组合物制成大于约0.1m铝的摩尔浓度。在另一个实施方案中，组合物具有约4/1至约1/1的铝/苏木精摩尔比。在一个实施方案中，组合物具有约3/1至约1.5/1的铝/苏木精摩尔比。在另一个实施方案中，组合物具有约2/1的铝/苏木精摩尔比。在又一个实施方案中，组合物为约0.01m至约0.1m氯离子。在一个实施方案中，组合物为约0.02m至约0.08m氯离子。在另一个实施方案中，组合物为约0.04m氯离子。

在示例性实施方案中，苏木精染色组合物中的苏木精具有约0.01m至约0.05m的摩尔浓度。在另一个实施方案中，苏木精染色组合物中的苏木精具有约0.02m至约0.04m的摩尔浓度。在又一个实施方案中，苏木精染色组合物中的苏木精具有约0.03m的摩尔浓度。在另一个实施方案中，组合物包含碘酸钠，其中碘酸钠具有约0.001m至约0.01m的摩尔浓度。在另一个实施方案中，组合物包含碘酸钠，其中碘酸钠具有约0.003m至约0.008m的摩尔浓度。在一个实施方案中，组合物包含碘酸钠，其中碘酸钠具有约0.005m的摩尔浓度。在另一个实施方案中，组合物包含铝，其中铝具有约0.1m的摩尔浓度。在又一个实施方案中，组合物包含铝，其中铝具有大于约0.1m的摩尔浓度。

在另一个实施方案中，将组合物制成约0.01m至约0.1m氯离子的摩尔浓度。在一个实施方案中，将组合物制成约0.02m至约0.08m氯离子的摩尔浓度。在另一个实施方案中，将组合物制成约0.04m氯离子的摩尔浓度。

在另一个实施方案中，苏木精染色组合物中的氯离子具有约0.01m至约0.1m的摩尔浓度。在另一个实施方案中，苏木精染色组合物中的氯离子具有约0.02m至约0.08m的摩尔浓度。在又一个实施方案中，苏木精染色组合物中的氯离子具有约0.04m的摩尔浓度。

在一个实施方案中，组合物基本上不含多糖、穴醚、穴番、穴状配体、冠醚、树枝状大分子、纳米管、杯芳烃、缬氨霉素或尼日利亚菌素。在另一个实施方案中，组合物基本上不含抗氧化剂。在一个实施方案中，组合物的ph为约2至约2.7。在另一个实施方案中，组合物的ph为约2.2至约2.6。

iv.制备苏木精组合物的方法

在示例性实施方案中，制备苏木精制剂的方法包括将苏木精加入到溶剂中；加入足以将至少一部分苏木精转化成苏木因的量的化学氧化剂；加入媒染剂和抗衡离子，其中制剂具有约2.5/1至约1/4的cl^-/so4^2-摩尔比。在一个实施方案中，媒染剂包括al2(so4)3、al2(so4)3·16h2o、alm(so4)2·12(h2o)、al2(so4)3·6h2o、al2(so4)3·18h2o、[al(h2o)6]2(so4)3·5h2o、alcl3或alcl3·6h2o的混合物，其中m是一价阳离子。

本文描述的苏木精组合物根据该一般方法制备：

1.将苏木精加入/溶解到水溶液中。

2.加入/溶解化学氧化剂。

3.加入/溶解媒染剂。

4.必要时，调整cl^-/so4^2-摩尔比

5.必要时，加入其它添加剂。

因此，在一个实施方案中，制备苏木精制剂的方法包括将苏木精加入到溶剂中；加入足以将至少一部分苏木精转化成苏木因的量的化学氧化剂；加入媒染剂和抗衡离子，并将cl^-/so4^2-摩尔比调整为约2.5/1至约1/4的摩尔比。

虽然以此顺序公开，但是可以以不同的顺序进行特定的步骤。例如，可以在第一溶液中制备苏木精，并且在第二溶液中制备其余组分。然后可以通过组合溶液来制备最终组合物。此外，媒染剂、氧化剂和其它添加剂可以以不同的顺序制成而仅有最小的影响。例外是向苏木精中加入化学氧化剂。似乎(至少是观察所得的(anecdotally))应根据一些实施方案在媒染剂之前加入化学氧化剂。某些其它组分可用于调整cl^-/so4^2-摩尔比。例如，可以使用任何含氯离子的盐来调整cl^-/so4^2-摩尔比(例如nacl)。或者，可以使用氯化硫酸铝(其为具有硫酸根离子和氯离子阴离子的铝盐)作为媒染剂，然后适当时可以使用盐，以进一步调整cl^-/so4^2-摩尔比。获得适当的cl^-/so4^2-摩尔比的另一种方法是使用制剂中任何成分的氯离子盐(例如，使用成分的盐酸盐代替通常的游离碱)。

在一些情况下，使用本文所述的组合物的这些策略也可能提供稳定性益处。在又一种方法中，可以加入具有氯离子抗衡离子的酸以调节cl^-/so4^2-摩尔比和ph。然而，可以使用这种方法加入的氯离子的量将受到对溶液的ph的约束的限制。特别地，苏木精溶液的ph有利地在约2至约2.7，或约2.2至约2.6。

v.使用苏木精组合物的方法

在示例性实施方案中，用自动染色器染色生物样品的方法包括使用自动染色器使生物样品与本文所述的苏木精组合物接触。在一个实施方案中，所述方法进一步包括使样品与复染剂接触。在另一个实施方案中，所述复染剂选自伊红y、橙黄g、亮绿sf淡黄、俾斯麦棕(bismarkbrown)和快绿fcf。在另一个实施方案中，所述方法包括使样品与苏木精组合物接触，所述苏木精组合物包含渐进性(progressive)苏木精染色方案。在另一个实施方案中，将样品与苏木精组合物接触包括递减性(regressive)苏木精染色方案。在又一个实施方案中，将生物样品支撑在基底上。在一个实施方案中，基底包括显微镜载玻片。在另一个实施方案中，生物样品包括组织切片或细胞学样品。在一个实施方案中，所述方法包括苏木精和伊红(h&e)染色方法。在另一个实施方案中，所述方法包括巴氏(pap)染色方法。

所有染色均使用自动化染色仪器进行。该仪器用于自动化盖玻片和加热固化(92℃)。所有研究中的组织载玻片是5-1symphonysystemmulti-blocktestslides(p/n1707100)，其具有安装在单个载玻片上的五种不同组织类型(肝脏、皮肤、肾脏、扁桃体、小肠)。大多数研究使用同时应用测试和对照制剂。将对照制剂描述为ans，并在实施例1中描述。使用随机对的连续组织切片以最小化组织形态的变化。

测试了各种染色参数，但对于每个研究，最常用的程序被描述为标准“中”级染色方案h2a30e120d70，其具有2分钟的苏木精孵育(h2)、30秒的酸洗(a30)、120秒的伊红孵育(e120)和70秒的分化(d70)。然而，另外的研究分别使用标准“低”和“高”级染色方案，h1a180e30d70和h10a30e420d70，证实了测试制剂可以在所有方案的染色质量方面充分匹配ans。然后以盲法格式向病理学家提供至少8个(但大多数情况下为16个)用测试和对照苏木精溶液处理的连续切割组织对，以评估差异的数量和程度，允许任何变化的统计学显著性使用fisher精确检验确定。

自动化染色仪器现在通常在将其沉积到载玻片上之前过滤苏木精，以便产生具有较少非特异性信号的载玻片。本文所述的程序的另一方面是去除主要苏木精过滤器，使得溶液中的任何沉淀物在载玻片上将是显而易见的。因此，使用根据本公开的组合物的方法的一个方面是将未过滤的组合物加入到样品中。观察到本文公开的示例性组合物，特别是实施例4，在载玻片上没有向如实施例1的组合物所见的那些显示沉淀。此外，即使在组合物已经存放并在染色中连续使用超过六周之后，自动染色器的硬件同样保持没有明显的沉淀物。

实施例

提供以下实施例以示例说明工作实施方案和一般方案的某些特定特征。本发明的范围不限于以下实施例所例示的那些特征。

实施例1

ans苏木精制剂是基于使用al2(so4)3·nh2o作为媒染剂，并且已经使用ventanasymphony自动染色器专门优化以用于自动化h&e染色。该制剂基于美国专利8,551,731中公开的那些。该苏木精制剂根据以下制剂制备：

组合物根据以下操作制备：

1.将苏木精加入/溶解到水和乙二醇的溶液中。

2.加入/溶解碘酸钠。

3.加入/溶解al2(so4)3·16h2o

4.加入/溶解氢醌和β-环糊精

该组合物被用作自动化染色性能的基准，因为它是最知名的组合物。该组合物能够在大约两分钟内在载玻片上递送适当的染色。虽然组合物染色良好，具有正确的色调和深度，并且具有足够的长期稳定性；但在任何意义上都不理想。具体地，该组合物随时间的推移而沉淀，并且这以负面的方式影响染色仪器的线路。虽然这可以通过适当的维护和清洁来减轻，但维护和清洁的频率和程度被认为是太大了。此外，沉淀物可能最终在染色的载玻片上显示出来。虽然这些沉淀物是明显的，但它们不会产生评分问题，因此主要从美学角度来看是该组合物的消极方面。加入氢醌和β-环糊精会使组合物具有相对较高的成本。最后，氢醌在一些管辖区被列为致癌物。使用ans苏木精的典型染色可见于图2(a)。图2(a)按照以下方案染色：

使用未过滤的苏木精溶液在symphony“5合1”测试载玻片上评估功能性染色。

实施例2

制备具有1/0的cl^-/so4^2-摩尔比(即100％cl^-)的苏木精制剂。除了使用alcl3六水合物代替al2(so4)3·16h2o以外，使用与实施例1相同的成分和浓度。

观察到该组合物非常稳定，但在染色期间也具有非常慢的动力学。因此，在正常操作条件下染色非常浅。

实施例3

制备具有1/1的cl^-/so4^2-摩尔比(即50％cl^-)的苏木精制剂。在这样的配制中，包括so4^2-，因为它完全从ans-cl去除，导致染色质量(染色的深度和色调)差和不可接受的动力学(例如对于自动化染色来说太慢)。此外，苏木精的浓度也增加，以增加动力学，这被认为被cl^-的存在所抑制。

制剂表现出高质量染色和足够的染色速率。几次实验后，得出结论，与ans相比，更高浓度的苏木精可用于确保染色动力学匹配ans基准。观察到组合物在延长的时间段内足够稳定，而不包括ans中包括的β-环糊精或氢醌。还观察到，该制剂具有显著延迟的沉淀开始，这被认为是cl^-浓度的影响。

实施例4

虽然ans-cl-50的染色性能和动力学达到或超过ans的基准性能，但发现实施例4具有进一步增强的性能。

在染色质量、染色动力学和稳定性方面，该制剂超过ans-cl-50的性能，但还不包括已知的有害物质乙二醇。发现无毒的丙二醇可以代替乙二醇，同时协同改善染色质量和增加染色速率。我们的实验结果表明，大于1:1的cl^-/so4^2-摩尔比将进一步提高稳定性，但以较慢的染色动力学为代价。由于针对该组合物观察到的稳定性的增强是足够的，因此反应动力学较慢可能是不合理的。然而，这种组合物将是提供额外的时间、温度或动力学的有价值的染色组合物。增加染色动力学的方法包括调节ph较高、增加反应温度或增加反应混合物的浓度等。

实施例5

为了确定cl^-/so4^2-摩尔比的影响，制备了其中使用alcl3·6h2o和al2(so4)3·16h2o作为媒染剂的各种其它比例。调节ph以匹配ans色调。所有其它组分与ans(实施例1)相同。对于1:4cl^-/so4^2-摩尔比(20％cl^-)，观察到与ans相比时，可以获得等效的染色特性，但动力学显著更慢。此外，观察到沉淀的稳定性或起始劣于ans-cl-50。

实施例6

对于1:2cl^-/so4^2-摩尔比(33％cl^-)，包括如实施例5所述的所有组分。此外，除了摩尔比变化以外，与实施例5相比，组分的浓度增加了25％。观察到与ans相比时，可以获得等效的染色特性，但动力学显著更慢。此外，观察到沉淀的稳定性或起始劣于ans-cl-50。

实施例7

对于1:2cl^-/so4^2-摩尔比(33％cl^-)，除了与实施例5相比浓度增加50％以外，包括如实施例6所述的所有组分。观察到与ans相比时，可以获得等效的染色特性，并且动力学基本上等同于ans。

实施例8

实施例8示例说明1:7cl^-/so4^2-摩尔比(12.5％cl^-)。发现实施例8具有进一步增强的性能。

在染色质量、染色动力学和稳定性方面，该制剂超过了nt-ans-cl-50的性能，并且不包括乙二醇。观察到与ans相比时，可以获得等效的染色特性，并且动力学基本上等同于ans。通过加入没食子酸一水合物获得的结果对应于没有没食子酸一水合物的实验中观察到的结果(实施例4)。

实施例9

仅在实施例7和实施例3中进行45℃的加速稳定性研究，所述实施例7和实施例3与ans等效地染色。观察到实施例7与ans一样快地形成沉淀，但实施例3在32天研究中不形成沉淀。

实施例10

本文所述的各种组合物在室温或45℃或在使用前的一段时间内储存在密闭的容器中。在其余实施例中，提供了比较各种组合物的显微照片，以便传达染色质量和沉淀程度。

图2(a-f)是用以下溶液染色的在10×放大倍数取出的4微米厚组织切片的连续切片的显微照片：(a)新鲜制备的实施例1的苏木精溶液、(b)新鲜制备的实施例4的苏木精溶液、(c)如实施例9所述经过加速老化(45℃，32天)的实施例1的苏木精溶液和(d)如实施例9所述经过加速老化(45℃，32天)的实施例4的苏木精溶液；图2(e)和图2(f)是图2(c)和图2(d)所示的相同切片，分别用更近的视角(例如数字变焦)示出。

在45℃储存的ans苏木精的功能性染色显示在～7天开始沉淀物量增加。在相同条件下(超过6周)，针对ans-cl苏木精在长时间后没有检测到沉淀物的迹象。

对于苏木精包装也观察到沉淀的差异。图3(a-b)是显示苏木精溶液在其接触表面上的沉淀的照片。图3(a)显示在瓶被排干并用di水淋洗之后，已预先在45℃含有苏木精32天的两个瓶(聚对苯二甲酸乙二醇酯改性的)，左图显示含有如实施例1所述的制剂的瓶，右图显示含有实施例4的制剂的瓶。图3(b)显示所述管路被排干并用di水淋洗，在60℃含有溶液7天之后，将在自动染色器中发现类似于这种类型的管路。左管含有如实施例1所述的制剂，右管含有如实施例4所述的制剂。在所有情况下，ans苏木精溶液在管路内产生比任何基于氯离子的苏木精溶液明显更多的沉淀物涂层。

现在参考图4(a-b)，其显示用以下溶液染色的4微米厚组织切片的连续切片的显微照片：(a)如实施例10所述经过加速老化(45℃，32天)的实施例1的苏木精溶液；和(b)如实施例10所述经过加速老化(45℃，32天)的实施例4的苏木精溶液。参考图4(a)，所见的核染色的强度基本上比图4(b)中观察到的强。这使得图4(a)的染色劣于图4(b)，因为病理学家通常喜欢较暗的核染色强度。此外，目视可观察到的苏木精沉淀物(图4(a)的左上部分)是在苏木精染色的样品上观察的不良特性。沉淀物通常会模糊潜在的组织形态，从而导致诊断困难，在图4(b)所示的样品中，虽然存在苏木精沉淀物，但沉淀物的大小明显较小，并且在较小程度上掩盖潜在的组织形态。此外，染色的强度仍然足够暗，以允许准确诊断。