技术领域：本发明属于干细胞组织工程领域及神经生物学领域，具体涉及一种生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法。
背景技术：
：青光眼是一组威胁和损害视神经及其视觉通路，最终导致视觉功能损害，主要与病理性眼压升高有关的临床征群或眼病。其视神经病变的特征是视网膜神经节细胞(RGC)的渐进性丧失以及其轴突与大脑中枢连接的损害。目前临床上降低眼内压的主要治疗，虽可以减缓疾病进展，但并不能完全阻止病情的进一步发展，尤其是对于晚期青光眼的患者更是收效甚微。因此，有必要寻找一种新的治疗策略，减缓或阻止进行性的RGC损害。现已有许多研究通过运用干细胞及组织工程学技术，对青光眼神经保护和细胞替代两方面进行了积极的尝试并取得了较大进展。但干细胞移植中存在诸多复杂和关键的问题：如细胞生长部位难以精确控制；移植细胞不能完全生长分化且难以与宿主细胞有效整合，形成功能性突触链接；移植入眼内的细胞存活率较低等等。将干细胞和组织工程学有机结合，可增进或改善视网膜受损组织修复的形态及功能为确保移植体系的质量，有必要对接种于组织支架进行体外培养分化的细胞进行形态及功能的评估和检测。
技术实现要素：
：本发明的目的是提供一种生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法，利用该方法可以直接反映神经支架上生长的神经样细胞离子通道电流，记录细胞膜上离子通道分子活动，可作为神经支架功能评价的一项重要指标。本发明的生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法，其特征在于，包括以下步骤：将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行诱导分化，形成生物工程视网膜神经支架，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基；对培养到一定时期的生物工程视网膜神经支架上的神经样细胞进行全细胞记录模式离子通道电流记录，通过支架细胞电位检测反映生物工程视网膜神经支架神经基础功能。优选，所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF10ng、BDNF20ng、CNTF20ng、N2supplement1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合而成。优选，所述的诱导分化是在37℃、5％CO2，饱和湿度下进行诱导分化。优选，所述的将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞是将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。优选，所述的全细胞记录模式离子通道电流记录，其灌流液成分为：NaCl124mmol/L，KCl2.5mmol/L，NaH2PO41.25mmol/L，MgSO42.0mmol/L，CaCl22mmol/L，NaHCO326mmol/L，glucose10mmol/L，灌流液通以95％O2+5％CO2混合气体。优选，所述的全细胞记录模式离子通道电流记录，其电极液成分为：CsCl150mmol/L、EGTA11mmol/L,CaCl21mmol/L,MgCl21mmol/L,HEPES10mmol/L,用CsOH调pH至7.4，电压钳制保持电位为-80mV，去极化电压为-10～+40mV，步阶电压10mV，去极化钳制时间10～40ms。优选，所述的对培养到一定时期的生物工程视网膜神经支架上的神经样细胞进行全细胞记录模式离子通道电流记录是将培养到一定时期的生物工程视网膜神经支架上的神经样细胞，吸除其培养基，用PBS洗涤后，在细胞贴附式状态下给予电压脉冲刺激，检测生物工程视网膜神经支架整体细胞产生的电活动，从而记录到生物工程视网膜神经支架全细胞膜离子电流。本发明人团队前期已成功将人源性的iPSc细胞诱导分化为人iPSc源性的3D视网膜(XiufengZhong,etal.Generationofthree-dimensionalretinaltissuewithfunctionalphotoreceptorsfromhumaniPSCs,NatCommun.2014Jun10；5:4047)。本发明将hiPSC来源的三维视网膜组织中的神经层细胞接种于PLGA组织膜片，构建了一个人iPS源性的可降解神经支架(iRP)。通过前期实验观察发现，同一批神经层细胞分别接种于PLGA膜片及普通盖玻片上，其生长分化的形态并不完全相同。因此选择直接对iRP上培养的神经细胞进行细胞电位的测量，直接反映神经支架(iRP)上的神经样细胞离子通道电流，记录细胞膜上离子通道分子活动，为进一步评估神经支架功能评价提供依据及基础。附图说明：图1是本发明对生物工程视网膜神经支架(iRP)上特征性突触的hiPSC源性神经细胞进行筛选，选择轴突生长良好特性的iRP进行细胞电位的测量；图2是本发明对iRP上hiPSC源性神经细胞进行细胞电位的测量，通过给予电压脉冲刺激，检测iRP整体细胞产生的电活动；图3是本发明所记录到的生物工程视网膜神经支架(iRP)的全细胞膜离子电流。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：一、生物工程视网膜神经支架(iRP)的制作：1、采用机械分离的办法，将培养50-60天的人iPSc源性的3D视网膜(具体制备方法参考文献：XiufengZhong,etal.Generationofthree-dimensionalretinaltissuewithfunctionalphotoreceptorsfromhumaniPSCs,NatCommun.2014Jun10；5:4047)的神经纤维层放入D-Hanks液中，于50倍正置显微镜下使用0.45mm针头分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分(色素层)，保留金黄色的组织部分(神经纤维层)；将分离的神经纤维层组织使用移液管转移至3.5cm培养皿，使用PBS冲洗10分钟；吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞，置于37℃培养箱中30min；过程后期可将细胞吸入离心管吹打，在10倍正置显微镜下见细胞团被消化成单细胞后加入2ml诱导分化培养基终止消化。将混悬液离心(1000转/5min)后吸出上清，得到种子细胞(沉淀)，将种子细胞中加入诱导分化培养基吹打混匀，将该含有种子细胞的诱导分化培养基分别移入预先底层铺有PLGA膜片并用基质胶Matrigel包被的96孔板中(种植密度：1×105个/cm2)，摇动孔板使细胞均匀，37℃、5％CO2饱和湿度下进行诱导分化，形成生物工程视网膜神经支架(iRP)。所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF10ng、BDNF20ng、CNTF20ng、N2supplement1ng、非必须氨基酸(essentialmedia-nonessentialaminoacidsNEAAs)1ng、肝素2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合而成。其配制方法为：将DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合形成DMEM/F12培养基，然后按照上述成份的含量，在DMEM/F12培养基中添加bFGF、BDNF、CNTF、N2supplement、非必须氨基酸和肝素，混合均匀而得诱导分化培养基。二生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量：1.制作微电极：应用软质苏打玻璃(降低电极的串联电阻)，先使玻璃管中间拉长成一窄细状，再拉制窄细部位断成二根；玻璃毛细管外部直径1.2mm，内径1mm，尖端直径为3μm，充入电极内液后电极电阻5MΩ；2.充灌电极液：用拉细的聚乙烯胶管从电极尾端插入到电极尖端灌注电极液。灌流液成分(mmol/L)为：NaCl124，KCl2.5，NaH2PO41.25，MgSO42.0，CaCl22，NaHCO326，glucose10，溶剂为水；电极液成分(mmol/L)为：CsCl150,EGTA11,CaCl21,MgCl21,HEPES10,溶剂为水，用CsOH调pH至7.4；电压钳制保持电位为-80mV，去极化电压为-10～+40mV，步阶电压10mV，去极化钳制时间10～40ms。3.生物工程视网膜神经支架(iRP)神经细胞的分离：选择细胞膜完整、平滑、清洁的生物工程视网膜神经支架(iRP)(步骤一培养的)，使其在灌流液中浸泡静止1小时后，取出放入新鲜置换的灌流液，于36℃恒温震荡(60次/min)水浴中孵育1小时；取出iRP，使用灌流液反复冲洗，于室温下静止1小时后轻柔吹打(图1)；4.电压封接:用灌流液进行灌流iRP，给予一个20mV，50ms的矩形波刺激，当电极进入灌流液时，记录电流直线变成与矩形波电压脉冲相对应的矩形波曲线，将电极尖轻轻压在细胞膜表面，此时电流曲线的高度变低，给电极以负压吸引，电极尖与细胞膜逐渐密接，细胞膜与电极间的电阻逐渐增加，电流曲线逐渐减小直至变成一条直线，形成电压封接(图2)。5.生物工程视网膜神经支架(iRP)神经细胞电流记录：在细胞贴附式状态下给予电压脉冲刺激，使电极尖端膜片在管口内破裂，通过电极进行膜电位固定，记录全细胞膜离子电流(图3)。结果：共培养7天后生物工程视网膜神经支架(iRP)上神经细胞发育良好，轴突直径23.29um，长度可达979.67um，可进行进行细胞电位的测量(图1)；利用三维操纵器移动拉直电极贴近生物工程视网膜神经支架(iRP)膜表面光滑清晰的目标细胞，加负压形成1GΩ水平以上的高阻抗封接吸破细胞膜，形成普通的全细胞记录形式，以成功测量iRP整体细胞电位(图2)；电压脉冲刺激后可观察到iRMP动作电位明显增高(-50mV--20mv)，表明该iRMP具有基本的电生理活动(图3)。离子通道是由细胞膜上的特殊蛋白质形成的可以让离子通过细胞膜的通道。离子通道根据启动方式可分为电压门控型通道及配体门控型通道，其中电压门控型离子通道与细胞膜动作电位关系密切。细胞电活动是生命现象的基本特征之一，而离子通道是其结构和功能的基础。因此,研究生物工程视网膜神经支架(iRP)神经细胞膜动作电位情况具有重要意义。本发明用全细胞膜离子电流测量方法对iRP上神经样细胞的离子通道膜电位进行检测，结果显示神经样细胞上有离子膜电位，为后续研究iRP神经功能提供了基础。