一种快速测定茶叶中农药残留的前处理方法及定量分析方法与流程

本发明属于快速分析检测技术领域，特别涉及一种快速测定茶叶中农药残留的前处理方法及定量分析方法。

背景技术：

茶叶是我国重要的农产品，也是我国传统的出口商品，由于具有独特的芳香气味，同时含有多种对人体有益的物质，已成为世界上最受欢迎的饮品之一。然而，在茶叶种植过程中，病虫害较多，为了减少病虫草对茶叶产量和质量的影响，在生产过程中不可避免的使用各种农药，这些农药最终可能会残留在茶叶中，给人类健康带来严重威胁。许多国家和相关机构已规定了茶叶中多种农药最大残留量(MRLs)，从而保证消费者的健康以及国际贸易的顺利进行。因此，为了保障茶叶质量安全的最后一道防线，建立简单有效、高灵敏度的分析方法用于茶叶中农药残留的检测是十分必要的。

在茶叶中农药残留的检测中，茶叶中大量的色素、甾醇、生物碱、茶多酚等基质组分不仅会降低检测结果的灵敏度和选择性，而且还会对色谱柱、离子源和检测器等造成极大的损害。因此，在进行仪器分析前，通常需要采用合适的样品前处理技术避免基质对目标物分析的干扰，提高检测结果的准确性。目前，文献上已报道过多种茶叶样品的前处理方法，如凝胶渗透色谱(GPC)、固相萃取(SPE)、分散固相萃取(DSPE)、基质固相分散萃取(MSPD)、固相微萃取(SPME)等，然而这些方法通常较为繁琐，使得检测方法耗时过长。因此，发展简便、高效的样品前处理技术用于农药残留的检测是尤为关键的，能够有效地保证茶叶中农药残留检测分析方法的建立。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术中的不足，提供一种快速测定茶叶中农药残留的前处理方法及定量分析方法，提取液中茶叶基质的含量大大减少，净化处理效果好，且农药的回收率基本不受影响，大大提高了样品前处理的效果，结合气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)对农药进行分离检测，大大提高了农药的分离效率，检测灵敏度和准确性高，且方法具有很好的重现性。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种快速测定茶叶中农药残留的前处理方法，包括如下步骤：

1)提取：将茶叶浸泡于水中，加入乙腈(ACN)提取茶叶中农药残留，然后加入醋酸钠(NaOAc)进行盐析，使乙腈和水进行相分离，所得上层乙腈层即为茶叶提取液；

2)净化：将步骤1)所得茶叶提取液中加入活性炭(AC)、N-丙基乙二胺固相吸附剂(PSA)和硫酸镁(MgSO₄)进行净化，然后经固液分离后，所得上清液即为茶叶净化液，可以作为快速测定茶叶中农药残留的待测液。

按上述方案，所述茶叶预先进行匀质化处理。

按上述方案，所述茶叶与水的质量比在0.2-1范围内。

按上述方案，所述浸泡时间为5min以上，优选5-80min。

按上述方案，所述乙腈的体积与茶叶的质量的比例范围为(2.5-10)mL：1g；提取时间在0.5-10min范围内。

按上述方案，所述醋酸钠与水的质量比在0.25-1.00范围内。在盐析过程中，本发明加入NaOAC取代传统的无机盐，其与传统的QuEChERS提取方法相比较，效果十分突出。传统的QuEChERS方法在提取过程中通常同时加入硫酸镁(MgSO₄)和NaOAC(或NaCl)，而NaOAC的量加入较少(与水的比例在0.1左右)，我们将醋酸钠的量提高了2.5-10倍，茶叶提取液中的茶叶基质较传统方法少了很多，而对茶叶中残留农药的提取效率没有影响。

按上述方案，所述活性炭(AC)与茶叶的质量比为0.01-0.5；所述N-丙基乙二胺固相吸附剂(PSA)与茶叶的质量比为0.1-2；所述硫酸镁(MgSO₄)与茶叶的质量比为0.2-2；净化时间优选0.2-2min。活性炭的吸附能力很强，本领域技术人员通常在净化茶叶时不采用活性炭，以避免活性炭对其中的农药残留进行吸附，从而影响对茶叶中农药残留的准确测定。本发明中意外尝试了加入少量活性炭作为吸附剂之一，发现并不影响农药残留的回收，反而会优先吸附茶叶中其他物质，最终净化效果非常突出。

本发明在上述快速测定茶叶中农药残留的前处理方法的基础上，进一步提供一种快速测定茶叶中农药残留的定量分析方法，即将快速测定茶叶中农药残留的待测液采用标准曲线法经气相色谱-串联质谱进行定量分析。具体包括如下步骤：

(1)按照本发明所述前处理方法，制备快速测定茶叶中农药残留的待测液；

(2)采用空白基质匹配的校准曲线，将若干种农药在茶叶的空白基质中配制成一系列浓度的标准混合溶液，并用气相色谱-串联质谱进行分析，然后以每一种农药以其浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标，绘制每种农药的线性标准曲线；

(3)将本发明所得快速测定茶叶中农药残留的待测液用气相色谱-串联质谱进行分析，分别根据出峰时间和定性定量离子对确定农药具体类别，并将其峰面积分别代入对应农药的标准曲线，从而得到待测液中农药的含量。

按上述方案，所述标准曲线的浓度线性范围在1-1000μg/kg。

按上述方案，所述若干种农药为1-69种，包括有机磷、有机氯、有机氮、菊酯类、苯基吡唑类等农药。

按上述方案，所述标准溶液的配制方法为：采用不含待测农药的空白茶叶样品按照本发明所述前处理方法处理，得空白茶叶基质；然后采用该空白茶叶基质将若干种农药配制成一系列浓度的标准混合溶液，标准混合溶液中每种农药的浓度均在线性范围内。

按上述方案，所述气相色谱-串联质谱的检测条件：采用中等极性的毛细管色谱柱进行分离，采用适当的程序升温的方法，串联质谱的多反应监测模式检测。最优选地，分离使用熔融石英毛细管色谱柱Rtx-5MS，30m×0.25mm id，膜厚0.25mm(Restek，Pennsylvania，USA)；气相色谱升温程序如下：在40℃保持4min，之后以25℃/min的速度升至125℃，再以10℃/min的速度升至300℃，保持6min，溶剂切除时间为7min；采用不分流模式进样，进样体积1μL；选用纯度为99.999％的氦气作为载气，载气流速为1.0mL/min；选用纯度为99.999％的氩气作为碰撞气；进样口、连接口和离子源温度分别为250℃、250°℃和230℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明在QuEChERS的提取过程中，单独使用乙酸钠(NaOAc)取代传统的QuEChERS方法中的无机盐诱导相分离，得到的乙腈提取液中茶叶基质的含量大大减少，且农药的回收率基本不受影响，大大提高了样品前处理的效果；

(2)本发明在QuEChERS的净化过程中，首次使用活性炭(AC)和N-丙基乙二胺固相吸附剂(PSA)作为吸附剂用以去除茶叶提取液中的基质干扰物，对茶叶的ACN提取液进行净化，大部分的农药的回收率都在70-120％之间，同时活性炭比传统的QuEChERS吸附剂GCB和C₁₈具有更好的去除色素的效果，大大提高了提取液净化的效果；

(3)与石墨化炭黑相比，活性炭具有比传统的QuEChERS吸附剂(GCB和C₁₈)更好的去除色素的效果，且价格非常便宜，大大降低了样品分析的成本，在茶叶农药残留分析中具有广泛的应用前景；

(4)本申请所述的前处理方法结合气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)对农药进行分离检测，大大提高了农药的分离效率，并建立了茶叶中可能含有的绝大多数农药快速、有效的多残留分析方法，检测灵敏度和准确性高，且方法具有很好的重现性，并能成功应用于市场上多种茶叶农残的分析检测。

附图说明

图1为本发明所述前处理方法实施例1与传统三种QuEChERS提取方法对比例1-3分别的得到的绿茶提取液(a)和净化液(b)的颜色对照图。

图2为实施例2所采用的净化液、所得净化液与对比例4和5所得净化液的颜色对照图。

图3a为实施例2所采用的净化液、所得净化液与对比例4和5所得净化液吹干的颜色对照图；图3b为实施例2实施例2所得净化液与对比例4和5所得净化液的基质干重对比。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例中活性炭(AC)比表面积为427m²/g，但本发明并不限于该种活性炭，只要是比表面积高于100m²/g的活性炭，均可用于本发明。

下述实施例中，69种农药标准品(1000μg/mL，丙酮或甲醇)均购自农业环境保护研究所(天津)，用色谱纯丙酮配制成10μg/mL的69种农药的混合溶液，在后续实验中，将其加入样品溶液得到所需要的浓度。所有的标准溶液在-20℃冰箱中避光保存，实验证明，在该条件下，所有农药标准品可稳定保存至少两个月。

下述实施例中，GC-MS/MS分析在岛津GCMS-TQ8030气质联用仪上进行，配有EOC-20i自动进样器(Kyoto，Japan)；数据采集和分析通过GC-MS工作站的软件(Shimadzu,Kyoto,Japan)完成；分离是在熔融石英毛细管上进行，型号是Rtx-5MS，30m×0.25mm id，膜厚0.25mm(Restek，Pennsylvania，USA)；进样量1μL。

下述实施例中，GC-MS/MS分析步骤的具体条件如下：气相色谱升温程序如下：在40℃保持4min，之后以25℃/min的速度升至125℃，再以10℃/min的速度升至300℃，保持6min，溶剂切除时间为7min；采用不分流模式进样，进样体积1μL；选用纯度为99.999％的氦气作为载气，载气流速为1.0mL/min；选用纯度为99.999％的氩气作为碰撞气；进样口、连接口和离子源温度分别为250℃、250℃和230℃。但本发明并不限定气相色谱-串联质谱分析的实验条件和仪器参数。

实施例1

一种快速测定茶叶中农药残留的前处理方法，

1)提取步骤：称取4.0g匀质化的茶叶样品于50mL离心管中，加入10mL纯水浸泡30min，然后加入20mL乙腈，涡旋1min；再加入4.0g NaOAc涡旋1min，随后以5000r/min的速度离心5min，乙腈和水相分离，所得上清液乙腈层即为茶叶提取液(如图1a所示)；

2)净化步骤：取实施例1中的1mL茶叶提取液，加入10mg活性炭(AC)、100mg N-丙基乙二胺固相吸附剂(PSA)和150mg的硫酸镁(MgSO₄)，涡旋1min后离心，收集上清液即为茶叶净化液(图1b)，可以作为快速测定茶叶中农药残留的待测液。

与传统QuEChERS提取方法的比较，对照例1-3如下：

对照例1：NaCl和MgSO₄提取：称取4.0g匀质化的茶叶样品于50mL离心管中，加入10mL纯水浸泡30min，加入20mL乙腈，涡旋1min；然后加入1.0g NaCl和4.0g MgSO₄涡旋1min，随后以5000r/min的速度离心5min，取出上清液即为提取液，作为对照例1。

对照例2：NaOAc和MgSO₄提取：称取4.0g匀质化的茶叶样品于50mL离心管中，加入10mL纯水浸泡30min，加入20mL乙腈，涡旋1min；然后加入1.0g NaOAc和4.0g MgSO₄涡旋1min，随后以5000r/min的速度离心5min，取出上清液即为提取液，作为对照例2。

对照例3：NaOAC(1％乙酸)和MgSO₄提取：称取4.0g匀质化的茶叶样品于50mL离心管中，加入10mL纯水浸泡30min，加入20mL乙腈(含1％乙酸)，涡旋1min；然后加入1.0g NaOAc和4.0g MgSO₄涡旋1min，随后以5000r/min的速度离心5min，取出上清液即为提取液，作为对照例3。

本实施例1所得提取液、对照例1-3所得提取液分别如图1a所示，很明显本实施例步骤1)所得提取液颜色更浅。

将对照例1-3所得提取液分别用100mg PSA、10mg AC和150mg MgSO₄进行净化，所得净化液分别如图1b所示，并与本实施例所得净化液进行比较，可知：本实施例采用改进的QuEChERS提取方法在后续净化过程中可以将色素颜色全部除去，为无色透明溶液；而对照例这三种方法只能去除部分色素，净化液仍带有浅黄色。

为了进一步验证本实施例与对照例1-3中所得提取液和净化液中基质含量的差别，分别取5mL提取液和净化液用N₂吹干后，比较其中基质的干重，结果如表1所示。

由表1可知：本发明采用改进的QuEChERS提取方法所得提取液中基质干重明显低于对照例三种提取液，经AC、PSA、MgSO₄吸附剂除杂净化后的干重更是大为减少，干重含量不到对照例1-3所得净化液的10％。

表1

实施例2

一种快速测定茶叶中农药残留的前处理方法，净化步骤如下：

取实施例1中的1mL茶叶提取液，加入10mg活性炭(AC)、100mg N-丙基乙二胺固相吸附剂(PSA)和150mg的硫酸镁(MgSO₄)，涡旋1min后离心，收集上清液即为茶叶净化液(图2)，可以作为快速测定茶叶中农药残留的待测液。

与传统QuEChERS净化方法进行比较，对照例4-5如下：

对照例4：取实施例1中的1mL茶叶提取液，加入10mg石墨化炭黑(GCB)、100mg N-丙基乙二胺固相吸附剂(PSA)和150mg的硫酸镁(MgSO₄)，涡旋1min后离心，收集上清液即为茶叶净化液，作为对照例4。

对照例5：取实施例1中的1mL茶叶提取液，加入10mg C₁₈、100mg N-丙基乙二胺固相吸附剂(PSA)和150mg的硫酸镁(MgSO₄)，涡旋1min后离心，收集上清液即为茶叶净化液，作为对照例5。

如图2所示，实施例2与对比例4、5的不同之处在于实施例2使用了活性炭净化，而对比例4和5中分别使用了GCB和C₁₈净化，很明显：实施例2所得净化液中色素几乎被吸附完全，而对比例4和5所得净化液样品还有较深的颜色。

同时，用称重法进一步比较实施例2和对照例4、5的净化效果：取等量上述净化液(5mL)用N₂吹干后，吹干后基质残留如图3所示，实施例2所得净化液中基质残留最小，仅为30％左右，而对比例4和5所得净化液的基质残留量有50％左右。

最后，我们也对69种农药的添加回收率进行了考察，如表2所示。结果表明：实施例2中大部分农药的回收率都在70-120％之间，可以满足分析检测的要求。因此，在净化过程中选择适量的AC，可以达到比传统QuEChERS吸附剂更好的除基质效果，同时不会对农药的回收率产生较大的影响。

表2

实施例3

目前，在茶叶种植过程中使用到的农药种类很多，本发明建立了通用的快速测定茶叶中农药残留的检测方法，本实施例选择了69种常用农药(包括有机磷、有机氯、有机氮、菊酯类、苯基吡唑类等)用于该方法的考察。为了获得更高的选择性和灵敏度，本实施例采用农药的标准溶液对该检测方法中的GC-MS/MS分析中农药的前体离子、产物离子、碰撞能量进行了优化，对每种农药优化了两个离子对，分别用于定性、定量分析，优化的结果如表3所示。

表3. 69种农药的保留时间、定性定量离子对以及碰撞电压

实施例4

为了验证本发明所提供的快速测定茶叶中农药残留的检测方法在实际应用中的可行性，本实施例对其线性、检出限(LODs)、定量限(LOQs)、精密度等参数进行了考察。在GC-MS/MS分析中，基质效应会严重影响分析物定量分析的结果，为了避免基质效应，本实施例采用空白基质匹配的校准曲线。标准曲线的建立过程如下：

1)称取4.0g匀质化的空白茶叶样品于50mL离心管中，加入10mL纯水浸泡30min，加入20mL乙腈，涡旋1min；然后加入4.0g NaOAc涡旋1min，随后以5000r/min的速度离心5min使乙腈和水相分离，得到提取的上清液，即为茶叶提取液；取1mL茶叶提取液至2mL离心管中，加入150mg MgSO₄、10mg AC和100mg PSA，涡旋1min后离心，收集上清液，即得空白茶叶基质；

2)采用该空白茶叶基质将69种农药配制一系列浓度的标准混合溶液，其中每一个标准混合溶液中每种农药的浓度均在1-1000μg/kg范围内，然后以每一种农药以其浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标，建立每种农药的线性标准曲线。

如表4所示，69种农药在1-1000μg/kg的范围内线性关系良好，回归系数的平方(R²)大于0.9929；并且，以信噪比的3倍和10倍计算出69种农药的检出限和定量限分别在0.1-1.8μg/kg和0.4-5.9μg/kg的范围内。

表4 69种农药在绿茶样品中的线性范围、线性方程、回归系数的平方(R²)、检出限(LODs)和定量限(LODs)

实施例5

为了评价本发明所提供的快速测定茶叶中农药残留的检测方法的准确性，本实施例对该方法的回收率进行了考察。具体步骤如下：

1)称取4.0g匀质化的空白茶叶样品于50mL离心管中，添加了低(10μg/kg)、中(50μg/kg)、高(200μg/kg)三个浓度的69种农药作为分析物，放置30min后，加入10mL纯水浸泡30min，加入20mL乙腈，涡旋1min，然后加入4.0g NaOAc涡旋1min，随后以5000r/min的速度离心5min使乙腈和水相分离，得到提取的上清液，即为茶叶提取液；

2)取1mL步骤1)所得茶叶提取液至2mL离心管中，加入150mg MgSO₄、10mg AC和100mg PSA，涡旋1min后离心，收集上清液，所得上清液即为茶叶净化液，可以作为快速测定茶叶中农药残留的待测液；

3)将步骤2)所得待测液在同样条件下进GC-MS/MS分析，分别根据出峰时间和定性定量离子对确定农药具体种类，将每种农药所得峰面积分别代入实施例4对应的线性方程中，计算得到待测样品中每种农药的浓度；然后通过计算的值除以添加的值即可以得到农药的添加回收率，结果如表5所示。

另外，我们以一天内单独配制4组平行样品进行实验，根据得到的检测结果计算出日内相对标准偏差；以连续4天单独配制的样品进行实验，根据得到的检测结果计算出日间相对标准偏差，结果如表6所示。

由表5所知：本发明所述方法中大部分农药的回收率在70～120％，RSDs低于13.9％；其中，少数几种农药如亚胺硫磷、蝇毒磷、苯醚甲环唑、久效磷、嘧霉胺等由于极易被AC吸附，故回收率偏低。由表6可知：本方法得到的日内相对标准偏差低于9.9％，日间相对标准偏差低于13.9％，说明本发明建立的快速测定茶叶中农药残留的检测方法重现性良好。

表5.茶叶中69种农药在低、中、高三个浓度水平下的平均加标回收率和RSD％(n＝4)

表6.方法的日内及日间精密度

实施例6

一种快速测定茶叶中农药残留的检测方法，本实施例对4个绿茶和4个红茶实际样品(所有实际样品来自湖北省各地区的超市及市场)进行分析，每个实际样品的具体步骤均如下：

1)称取4.0g匀质化的茶叶实际样品于50mL离心管中，加入10mL纯水浸泡30min，加入20mL乙腈，涡旋1min。然后加入4.0g NaOAc涡旋1min，随后以5000r/min的速度离心5min使乙腈和水相分离，得到提取的上清液，即为茶叶提取液；

2)取1mL步骤1)所得茶叶提取液至2mL离心管中，加入150mg MgSO₄、10mg AC和100mg PSA，涡旋1min后离心，收集上清液；所得上清液即为茶叶净化液，可以作为快速测定茶叶中农药残留的待测液；

3)将步骤2)所得待测液在同样条件下进GC-MS/MS分析，分别根据出峰时间和定性定量离子对确定农药具体类别，将每种农药所得峰面积分别代入实施例4对应的线性方程中，计算得到待测液中每种农药的浓度，并换算成茶叶实际样品中每种农药的浓度。

结果如表7所示，在8个茶叶实际样品中都检测出一定量的农药残留，检出率最高的农药是溴虫腈、氯氰菊酯、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯。

表7.实际茶叶样品的检出情况

注：n.d.表示未检出。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。