本发明涉及测定果醋饮料中乙酸稳定碳同位素比值(记作δ13C)的方法，属于稳定同位素分析
技术领域：
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背景技术：
：：：稳定同位素技术在食品成分的掺假检验中具有重要作用和应用价值，其在国外果醋饮料的真伪鉴别中已得到应用，也取得了一些成绩。根据国标(GB30884-2014)的规定，饮料用水果醋是以水果或浓缩果汁为原料经酒精发酵、醋酸发酵而成的液体产品，而果醋饮料则需以饮料用水果醋为基础原料，可加入食糖和(或)甜味剂、果汁等调制而成的饮料，不允许使用粮食等非水果发酵产生或人工合成的乙酸。因此，根据果醋饮料中乙酸的来源可初步判定产品真伪，而乙酸的同位素组成的准确测定就成了稳定同位素技术能否得到成功应用的关键。果醋饮料产品是一种除乙酸之外还有乙醇、糖类、有机酸、芳香物质构成的混合物，若不能将乙酸与其他有机物有效分离，乙酸碳同位素比值测定时难免会受到干扰，因此，如何有效分离乙酸与其他有机物是果醋饮料中乙酸碳同位素准确测定的关键所在。根据文献(HNMRand13C-IRMSanalysesofaceticacidfromvinegar,18O-IRMSanalysisofwaterinvinegar:Internationalcollaborativestudyreport)、(MeasurementoftheisotoperatioofaceticacidinvinegarbyHS-SPME-GC-TC/C-IRMS)、(Gaschromatography/isotoperatiomassspectrometry:Analysisofmethanol,ethanolandaceticacidbydirectinjectionofaqueousalcoholicandaceticacidsamples)、(有机溶剂稀释与气相色谱-燃烧-同位素质谱(GC-C-IRMS)联用测定食醋中乙酸的δ13C)可知，当前果醋中乙酸碳同位素组成的测定技术主要有固相微萃取技术结合气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱法、微蒸馏提取技术结合元素分析-稳定同位素比值质谱法以及有机溶剂稀释结合色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱法，前两种方法在国外的文献中有所报道，但是其整套方法所需时间长、消耗样品量大，且需要专门的技术人员进行前处理操作，同时由于这两种方法涉及到纯乙酸的提取过程，难免出现同位素分馏，因此这两种方法的稳定性和准确性均存在一定问题；第三种方法已获得国家发明专利保护(ZL201210473395.8)，而且该方法尽管使用有机溶剂稀释样品，进样时仍然含有一些水分(尤其是醋产品中乙酸含量较低时)，时间长了会损伤气相色谱柱。然而，上述三种方法只适用于乙酸含量较高的果醋，而果醋饮料乙酸含量较低，尚未见有果醋饮料中乙酸稳定碳同位素比值的报道。液相色谱-稳定同位素比值质谱技术的应用价值在大分子有机物质的碳同位素分析中已逐渐显现，如测定蜂蜜和果汁的糖类物质的碳同位素组成：(Anoverviewofanalyticalmethodsfordeterminingthegeographicaloriginoffoodproducts)、(Improveddetectionofhoneyadulterationbymeasuringdifferencesbetween13C/12Cstablecarbonisotoperatiosofproteinandsugarcompoundswithacombinationofelementalanalyzer-isotoperatiomassspectrometryandliquidchromatography-isotoperatiomassspectrometry)、(Liquidchromatographycoupledtoisotoperatiomassspectrometry:anewperspectiveonhoneyadulterationdetection)、(液相色谱-元素分析-同位素比率质谱联用法鉴定橙汁掺假)、(液相色谱元素分析-同位素比值质谱联用法鉴定蜂蜜掺假)；葡萄酒中的乙醇和甘油的δ13C值：(ResolutionOIV/OENO343/2010：Methodforthedeterminationofthe13C/12CisotoperatioofglycerolinwinesbyGasChromatographyCombustionorHighperformanceLiquidChromatographycoupledtoIsotopicRatioMassSpectrometry)的、(Simultaneousstablecarbonisotopicanalysisofwineglycerolandethanolbyliquidchromatographycoupledtoisotoperatiomassspectrometry)、(液相色谱-同位素比质谱法同时测定葡萄酒中甘油和乙醇的δ13C值)，并且由于流动相是液体状态，尤其适用于含水量较多的样品的分析。李鑫等(稳定同位素比率技术对食醋真伪鉴别的应用初探)在液相色谱-稳定同位素比值质谱上安装反相C18色谱柱实现了乙酸δ13C分析，但是由于反相C18色谱柱对食醋中复杂组分(除乙酸外的其他有机物)缺乏有效分离效果，不能将其与乙酸分开，因此使用消解的方式在80℃条件下除去醋样中的乙醇等物质，但是需要注意的是，该过程为非密闭条件操作，乙酸是极易挥发的物质，此过程中会因部分乙酸逸散而出现碳同位素分馏，造成测定结果不准确，而且消解步骤处理样品需要耗费时间，增加了样品分析难度。本研究针对果醋饮料中乙酸碳同位素快速分析的迫切需求和稳定性、准确性要求，借鉴液相色谱-稳定同位素比值质谱技术和阳离子交换色谱技术的先进性，通过液相色谱柱分离果醋饮料中不同有机组分然后测定乙酸碳同位素组成，为果醋饮料产品的真实性研究和掺伪检测技术的建立提供技术支持。技术实现要素：：(1)拟解决的问题针对果醋饮料产品中乙酸碳同位素的测定问题，建立一种快速、稳定、准确且不损伤仪器的测定乙酸δ13C的方法，为果醋饮料产品中乙酸碳同位素(δ13C)的分析及其应用提供技术方法。简言之，本发明基于果醋饮料产品的含水特性，采用不加入其他有机化学成分而直接利用液相色谱--稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS)实现对果醋饮料中乙酸δ13C的快速测定，解决以往果醋饮料中乙酸δ13C测定需纯化或引入其他有机组分、因水而影响色谱柱寿命的问题。本发明为乙酸δ13C的测定提供了另外一种可行性方案，将促进果醋饮料中乙酸δ13C研究和应用的进步，也为以后乙酸中δ13C的测定和果醋饮料产品的真伪鉴别提供技术方法。(2)本发明的具体方案本发明结合色谱分离理论和稳定同位素技术实现了果醋饮料中乙酸稳定碳同位素组成(δ13C)的更稳定、准确测定，且在测定前无需去除样品中存在的除乙酸以外的其他有机成分，如去除果醋饮料样品中的乙醇等物质。优选地，其中所述的果醋饮料为苹果醋饮料。具体而言，本发明提供采用液相色谱-稳定同位素比值质谱仪测定果醋饮料中乙酸δ13C值的方法，其中包括样品稀释、过滤的前处理步骤、液相色谱分离、在线反应装置氧化处理然后测定稳定同位素比值的步骤，且本发明中所述的样品前处理步骤不包括去除样品中存在的除乙酸以外的其他有机成分的步骤，如除去果醋饮料样品中的乙醇等其他有机物质。更具体而言，本发明测定果醋饮料中乙酸δ13C值的方法，包括以下步骤：1)仪器准备；2)样品前处理；3)测定碳同位素参考物质或工作标准；4)测定样品的δ13C测定值；5)计算样品的δ13C值。上述步骤中，所述的仪器准备为调整各项参数至工作状态：保护气为氦气；色谱柱为可耐纯水的液相色谱柱；柱流速为0.25～0.60mL/min；柱温为20～70℃；配制酸性流动相(pH为0～6)；调整反应助剂的浓度和流速至m/z＝32的背景信号强度为4000～18000mv；进样体积为20μL。所述的样品前处理包括稀释和过滤程序，将样品稀释至乙酸浓度0.1～1.2g/L，稀释后经滤膜过滤(水系，0.45μm或0.22μm)，任选地，确认稳定同位素比值质谱仪的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合要求，然后检验仪器测定CO2中δ13C的精密度和稳定性，必要时调整离子源参数值。本发明中所述的样品前处理步骤不包括去除样品中存在的除乙酸以外的其他有机成分的步骤，如除去果醋饮料样品中的乙醇等物质。(3)有益效果：本发明根据果醋饮料产品的理化特性及液相色谱-稳定同位素比值质谱技术特点实现了果醋饮料样品中乙酸δ13C值的高精度分析与测定，且在测定前无需去除样品中存在的除乙酸以外的其他有机成分，为果醋饮料产品的掺假检测研究、生产过程控制技术研究提供了一种新方法。具体实施方式：下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。实施例一：1.1仪器液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS，配备氧化接口Isolink)，上述仪器均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；1.2材料与试剂碳同位素参考物质：蔗糖(IAEA-CH-6，δ13CPDB＝-10.45‰)；超纯水(Milli-Q系统制备)；正磷酸(纯度≥99％)与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸(纯度≥99％)；乙酸(纯度≥99％)。1.3色谱条件HyperRezXPCarbohydrateH+色谱柱(7.7×300mm/8μm)；流动相为0.0005mol/L的硫酸溶液，流速为0.30mL/min；色谱柱温度为35℃。1.4氧化接口工作条件氧化接口(IsoLink)使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂，用IRMS同时监测m/z＝32、33和34的离子流信号强度，调整磷酸和过二硫酸钠溶液的浓度和流速确保m/z＝32的离子流信号强度为8000mV。1.5参考物质准备用超纯水和碳同位素参考物质(蔗糖)配制0.3g/L的蔗糖水溶液，保存待用。1.6样品前处理用超纯水配制0.3g/L的乙酸水溶液，经0.22μm滤膜过滤后保存待用。1.7测定分别进样测定蔗糖水溶液和乙酸水溶液的δ13C测定值，并根据蔗糖δ13C的测定值与真实值(-10.45‰)的差异计算得出乙酸的δ13C值。1.8结果分析连续10次测定纯乙酸的δ13C值，结果如表1所示。表1乙酸δ13C值重复测定结果12345678910δ13C(‰)-26.38-26.28-26.36-26.38-26.23-26.26-26.20-26.17-26.25-26.18由上表可知，本发明中LC-IRMS测定乙酸δ13C值的方法稳定性优异，其标准偏差仅为0.08‰，优于已知文献中乙酸δ13C值测定的精密度。实施例二2.1仪器液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS，配备氧化接口Isolink)，上述仪器均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；2.2材料与试剂碳同位素参考物质：蔗糖(IAEA-CH-6，δ13CPDB＝-10.45‰)；超纯水(Milli-Q系统制备)；正磷酸(纯度≥99％)与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸(纯度≥99％)；乙酸(纯度≥99％)；市售苹果醋与老陈醋。2.3色谱条件HyperRezXPCarbohydrateH+色谱柱(7.7×300mm/8μm)；流动相为0.0005mol/L的硫酸溶液，流速为0.30mL/min；色谱柱温度为35℃。2.4氧化接口工作条件氧化接口(IsoLink)使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂，用IRMS同时监测m/z＝32、33和34的离子流信号强度，调整磷酸和过二硫酸钠溶液的浓度和流速确保m/z＝32的离子流信号强度为8000mV。2.5参考物质和工作标准准备用超纯水和碳同位素参考物质(蔗糖)配制0.3g/L的蔗糖水溶液，保存待用。选择乙酸(纯度≥99％)为工作标准物质，用超纯水配制0.3g/L的乙酸水溶液，经0.22μm滤膜过滤后保存待用。2.6样品前处理用超纯水将苹果醋和老陈醋分别稀释至乙酸约0.3g/L，经0.22μm滤膜过滤后保存待用。2.7测定分别进样测定蔗糖水溶液δ13C蔗糖测定值和乙酸工作标准的δ13C乙酸测定值，测定苹果醋饮料与陈醋的δ13C乙酸测定值，并根据蔗糖δ13C的测定值与真实值(-10.45‰)、乙酸工作标准的测定值和校正值(-26.27‰)的差异计算得出样品中的乙酸δ13C值。2.8结果分析苹果醋饮料和陈醋样品分别平行处理3份，每份样品测定3次，结果见表2。表2醋样品分析样品乙酸δ13C(‰)标准偏差(‰)苹果醋饮料-24.770.10陈醋-15.390.09由上表可知，每个样品3次测定的标准偏差最大仅为0.10‰，这说明尽管样品中成分比较复杂，但是该发明的方法能够排除其它含碳有机物对乙酸δ13C测定的干扰，这表明该发明的方法测定醋中乙酸δ13C值的重复性满足碳同位素的分析要求。实施例三3材料方法3.1仪器液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS，配备氧化接口Isolink)。3.2材料与试剂碳同位素参考物质：蔗糖(IAEA-CH-6，δ13CPDB＝-10.45‰)；超纯水(Milli-Q系统制备)；正磷酸(纯度≥99％)与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸(纯度≥99％)；乙醇(HPLC级)；苹果醋饮料(共4个)和苹果醋(1个)。3.3LC-IRMS的工作条件HyperRezXPCarbohydrateH+色谱柱(7.7×300mm/8μm)；流动相为0.0005mol/L的硫酸溶液，流速为0.30mL/min；色谱柱温度为35℃；氧化接口(IsoLink)使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂，用IRMS同时监测m/z＝32、33和34的离子流信号强度，调整磷酸和过儿硫酸钠溶液的浓度和流速确保m/z＝32的离子流信号强度为8000mV。3.4样品准备LC-IRMS：苹果醋饮料样品均用超纯水稀释至乙酸约0.3g/L，经0.22μm滤膜过滤后保存待用；3.5测定用LC-IRMS测定市售苹果醋饮料和苹果醋中的乙酸δ13C值，结果见表3。表3LC-IRMS测定苹果醋饮料样品中乙酸δ13C值由上表可知，本研究选择的4个苹果醋饮料，其乙酸δ13C分布范围为-27.72‰～12.78‰，而苹果醋1#的值为-25.75‰，对比实施例二中陈醋的乙酸δ13C值(-15.39)，有理由怀疑苹果醋饮料1#和2#均不是纯正的苹果醋饮料，而是有可能生产过程中添加了外源的乙酸成分(有可能掺入了食醋)。最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。当前第1页1 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