本发明属于稳定同位素分析技术领域，具体涉及一种茶叶中烟碱碳稳定同位素比值的测定方法。
背景技术：
当前，判定市售烟草提取物及不同纯度烟碱中烟碱的来源，具有重要的意义。除烟草外，茶叶等作物也含有烟碱，虽然茶叶的烟碱含量相对很低，但与其他茄科类植物相比，其烟碱含量相对较高，所以，茶叶是自然界中烟碱的重要来源之一。当前，许多市售戒烟产品、电子烟、保健产品等都含有烟碱，但是，对于其中烟碱的来源，尚无统一定论。所以，烟碱溯源技术的开发，具有重要的理论及现实意义。
在产品品种、产地等溯源的方法中，稳定同位素技术是一项相对高效的分析手段。由于生物体内的同位素组成受气候，环境和生物代谢类型等因素的影响，不同种类及不同地域来源的食品原料中同位素自然丰度存在差异，利用这种差异可以对不同种类及来源的产品进行溯源(林光辉,稳定同位素生态学.高等教育出版社,2013)。但是，目前尚未见茶叶中烟碱碳稳定同位素比值的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的正是基于上述技术空白，建立了一种茶叶中烟碱碳稳定同位素比值的测定方法。本方法通过液液萃取、固相萃取等过程对茶叶中的烟碱进行提取、浓缩和净化，可克服茶叶中烟碱浓度偏低的不足，实现茶叶中烟碱碳稳定同位素比值的测定。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种茶叶中烟碱碳稳定同位素比值的测定方法，采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将茶叶中的烟碱提取出来 后，再经过阳离子交换固相萃取对萃取液进行净化，并采用配有毛细管色谱柱的气相色谱仪将烟碱和萃取液中的其他杂质分开，利用气相色谱—同位素质谱仪(GC-IRMS)分析烟中烟碱的碳稳定同位素比值δ13C，再根据烟碱同位素标准物质中的δ12C测定值，校准计算茶叶中烟碱的δ12C值。
其具体步骤如下：
(1)茶叶中的烟碱的提取、浓缩与净化：采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将茶叶中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对烟碱进行净化；
(2)采用带有毛细管气相色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分开；
(3)用在线燃烧装置将烟碱中的C转化成CO2，用同位素质谱仪(IRMS)测定烟碱产生CO2中的δ13C值；
(4)通过标准物质已标定的δ13C值，得到茶叶中烟碱的δ13C值。
本申请优选技术方案为：步骤(1)中的提取与净化过程如下：
⑴提取：称取茶叶样品，置于离心管中，分别加入1％氢氧化钠水溶液和正己烷，涡旋后，离心，将上层有机相转移至另一个离心管中，再以正己烷萃取，合并有机相；
⑵浓缩、净化：用甲酸将有机相的pH值调至3-4，然后将其氮吹浓缩近干，加入2％甲酸水溶液溶解残渣后，使用阳离子交换固相萃取小柱进行净化处理，其步骤为：萃取柱使用前分别用甲醇、水和2％甲酸水溶液活化，之后将待净化溶液转移至柱中，依次用3mL水和3mL甲醇淋洗，然后用10mL 5％氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液用甲酸调pH值至3-4，氮吹浓缩近干，残渣用5％氢氧化钠水溶液调pH值至碱性，加入二氯甲烷，涡旋后离心，再取有机相进行 GC-IRMS分析。
本申请更优选的技术方案为：
步骤(1)中的提取与净化过程如下：
提取：称取约5g茶叶样品，置于50mL离心管中，分别加入30mL 1％氢氧化钠水溶液和5mL正己烷，2000rpm下涡旋10min后，在10000rpm下离心2min，将上层有机相转移至另一个50mL离心管中，再以5mL正己烷萃取两次，合并有机相；
浓缩、净化：用甲酸将有机相的pH值调至3-4，然后在40℃下将其氮吹浓缩近干，加入3mL 2％甲酸水溶液溶解残渣后，使用阳离子交换固相萃取小柱(60mg，Waters Oasis MCX)进行净化处理，其步骤为：萃取柱使用前分别用3mL甲醇、3mL水和3mL 2％甲酸水溶液活化，之后将待净化溶液转移至柱中，依次用3mL水和3mL甲醇淋洗，然后用10mL 5％氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液用甲酸调pH值至3-4，40℃下氮吹浓缩近干，残渣用5％氢氧化钠水溶液调pH值至碱性，加入1.5mL二氯甲烷，在2000rpm下涡旋2min后，以10000rpm离心1min，再取有机相进行GC-IRMS分析。
所述方法的仪器分析条件为：
(1)气相色谱条件：
色谱柱：中等极性毛细管色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；检测器温度：250℃；进样口温度：250℃；载气：氮气(纯度≥99.999％)，恒流流速：2.0mL/min；进样量：1μL，不分流进样；升温程序：初始温度80℃，保持1min，以15℃/min的速率至260℃，保持6min.
(2)燃烧转化装置条件：
氧化燃烧管设置温度为1000℃，管内填装镍/氧化镍(Ni/NiO)，氧化镍作弱 氧化剂，将样品中的C氧化成CO2，将样品中N氧化成NxOy，同时，氧化镍转化为镍单质，充入O2可再生氧化镍，另外，镍单质可作特殊还原剂，将NxOy转化为N2，样品最终反应生成CO2和N2，氧化燃烧管使用前应注入O2一个小时用于氧化管的再生。
(3)质谱条件为：
离子源真空为1.8x 10-6mBar,电压3.04kV，电流1.50mA。
本方法通过液液萃取、固相萃取等过程对茶叶中的烟碱进行提取、浓缩和净化，可克服茶叶中烟碱浓度偏低的不足，实现茶叶中烟碱碳稳定同位素比值的测定,具有效率高、重复性好的优点，为烟草提取物中烟碱的溯源提供了技术支持和科学依据。
附图说明
图1为GC-IRMS测定标准溶液烟碱中δ13C的离子流图谱，其中上图纵坐标是比率(Ratio)，下图纵坐标是强度(Intensity[mV])
具体实施方式
本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。
实施例1：
1、仪器及试剂
同位素质谱仪(AS1310自动进样器，Trace GC Ultra气相色谱仪，GC IsoLink燃烧装置，Delta V Advantage稳定同位素比质谱仪。美国Thermo Fisher公司)；AE163电子天平(感量：0.0001g，瑞士Mettler公司)；全自动氮吹仪(型号：JTZD-DCY12S，杭州聚同电子有限公司)；高速粉碎机(武汉银彩科技有限公司)；漩涡振荡器(美国Coleparmer Votex-Genie)；高速台式冷冻型离心机(德国SIGMA 3-30K)；高纯氦气(99.999％，载气)；烟碱标准物质来自于美国印第安纳大学同位素实验室，#2(δ13C＝7.72±0.02‰)，#3(δ13C＝-30.05±0.02‰)，#4(δ13C＝-2.06±0.02‰)，#5(δ13C＝-29.63±0.01‰)；正己烷(色谱纯，美国TEDIA公司)；氢氧化钠(分析纯，国药集团)；超纯水(Milli-Q Integral超纯水系统制)；阳离子交换固相萃取小柱(60mg，Waters Oasis MCX)。
2、样品前处理
(1)将茶叶样品置于40℃烘箱中，1小时后取出，粉碎后过0.45毫米孔径标准筛；
(2)称取约5g茶叶样品，置于50mL离心管中，分别加入30mL 1％氢氧化钠水溶液和5mL正己烷，2000rpm下涡旋10min后，在10000rpm下离心2min，将上层有机相转移至另一个50mL离心管中，再以5mL正己烷萃取两次，合并有机相。
(3)用甲酸将有机相的pH值调至3-4，然后在40℃下将其氮吹浓缩近干，加入3mL 2％甲酸水溶液溶解残渣后，使用阳离子交换固相萃取小柱(60mg，Waters Oasis MCX)进行净化处理，其步骤为：萃取柱使用前分别用3mL甲醇、3mL水和3mL 2％甲酸水溶液活化，之后将待净化溶液转移至柱中，依次用3mL水和3mL甲醇淋洗，然后用10mL 5％氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液用甲酸调pH值至3-4，40℃下氮吹浓缩近干，残渣用5％氢氧化钠水溶液调pH值至碱性，加入1.5mL二氯甲烷，在2000rpm下涡旋2min后，以10000rpm离心1min，再取有机相进行GC-IRMS分析。
本案中的％若无特别说明，均为质量％。
3、仪器分析条件
(1)气相色谱条件：
色谱柱：中等极性毛细管色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；检测器温度：250℃；进样口温度：250℃；载气：氮气(纯度≥99.999％)，恒流流速：2.0mL/min；进样量：1μL，分流比：10:1；升温程序：初始温度80℃，保持1min，以15℃/min的速率至260℃，保持6min.
(2)燃烧转化装置条件：
氧化燃烧管设置温度为1000℃，管内填装镍/氧化镍(Ni/NiO)，氧化镍作弱氧化剂，将样品中的C氧化成CO2，将样品中N氧化成NxOy，同时，氧化镍转化为镍单质，充入O2可再生氧化镍，另外，镍单质可作特殊还原剂，将NxOy转化为N2，样品最终反应生成CO2和N2，氧化燃烧管使用前应注入O2一个小时用于氧化管的再生。
(3)质谱条件为：
离子源真空为1.8x 10-6mBar,电压3.04kV，电流1.50mA。
4、精密度测定
将茶叶样品稀释萃取后，通过本发明所述GC-IRMS技术重复测定茶叶中烟碱的δ13C值(n＝6)，测定结果的相对标准偏差(RSD)为1.16％(表1)，测定精度均能达到要求。
表1.茶叶中烟碱C、H、N三种元素稳定同位素比值的精密度测定
根据上述GC-IRMS测定方法，测得茶叶样品中烟碱的δ13C为-29.37。