一种高光谱分辨的扫描激光光学层析成像方法的系统与流程

本发明涉及光子学与生物医学交叉装置设计领域，尤其涉及一种光子学与生物医学交叉的扫描激光光学层析成像方法的领域。

背景技术：

生命科学和医学药学研究是现今世界科技发展和人类关注的最大热点之一。生物医学光子学作为光子学与生物医学交叉的学科新分支，涉及生物系统以光子形式释放的能量，来自生物系统的光子探测过程,以及光子所携带的有关生物系统的结构与功能信息等各个方面。由于该技术具有许多突出的优点，如特异性好、灵敏度高、分辨率高等，因此成为现代生命科学和生物医学的研究越来越倚重的重要研究工具。.

生物医学研究为了更好的理解生命活动、疾病发展甚至药物作用的机理，日益增加在完整的生物系统上高精度研究生物功能信息的需求。而传统的核磁共振(MRI)、X射线计算机断层扫描(X-ray CT)以及正电子发射计算机断层扫描(PET)等技术虽然可以获得三维成像，但成像对象主要局限在宏观的生物医学样本。同时它们并非光学成像技术，无法利用生物医疗上极为常用的染色/荧光标记等技术来对标记物分布进行成像。在生物医学光学成像领域，传统的共聚焦/多光子光学成像技术受光场限制及扫描速率限制，通常只能三维扫描成像几十至几百μm的样本[1,2]，难以满足生物医学研究为了更好的理解生命活动、疾病发展甚至药物作用的机理，日益增加在完整的生物系统上高精度研究生物功能信息的需求。因此，成像深度在mm-cm范围并且具有高空间分辨率(μm量级)的新型介观三维光学成像技术的研究一经提出，就受到世界生物医疗光学成像研究者的广泛关注，得到突飞猛进的发展，是目前生物医疗光学成像研究领域的前沿热点之一。

当前，实现介观三维光学成像的途径主要包括光学投影断层扫描(Optical Projection Tomography,OPT)[3]，扫描激光光学层析成像(Scanning Laser Optical Tomography，SLOT)[4]，光片显微仪(Light Sheet Microscopy)[5,6]。SLOT技术是光学计算机断层扫描(Optical Computed Tomography)范畴下的一种形式，采用单点激发并探测，利用激光扫描以形成投影成像，得到一系列角度相关的强度投影图像，然后基于计算机三维重组获到样本的三维立体强度信息，可采集样本的吸收/荧光。但目前局限于强度成像，而强度测量容易受激发光强度、样本猝灭和荧光染料或蛋白质的分布浓度等许多因素的影响，通常只用作定性测量，很难对样本进行有效地定量测量，更无法进行功能成像。

荧光自身其实具有多参量特性，除了上述所述强度外，荧光光谱、寿命和偏振等参数都包含了丰富的生物功能信息。由于荧光发射波长与荧光团的能级结构相关，因此荧光光谱测量与光学成像结合可区分不同的荧光团，并对空间分辨的生物化学功能信息成像。目前国内外的荧光光谱成像技术多结合微观三维成像技术(如共聚焦显微成像，多光子显微成像甚至超分辨荧光显微成像)，并主要应用于微观样本(如细胞、单分子等)，利用的是在横向(x,y)和轴向(z)进行扫描成像，成像区域小于甚至远小于几百个μm，无法适用于对生物医疗介观(mm-cm)样本(完整生物系统：器官、组织、胚胎及模式动物等)的研究。另外，结合的这些三维光学成像技术都受到空间精度各向异性的限制，易导致横向和轴向分辨率不一致引起的信息提取模糊的困扰。这些多维度荧光成像技术不易简单移植到生物医疗介观三维光学成像，其中严重的一个技术瓶颈就是两种技术结合后激发光子的有效利用率不高。

根据以上问题，本发明相较于以往传统方式，本发明成像高效快速，系统紧凑，操作方便，成像精度各向同性，可对样本进行三维立体信息的光谱分辨，适用于对样本进行结构和功能分析。尤其可以对完整地生物组织系统样本提供三维立体的光谱信息，光子利用率高，因此，本发明在光谱识别方面有着更多的优点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：如何选取高速的荧光光谱分辨技术结合扫描激光光学层析成像以形成高度原创性的技术原理和方案，实现高效快速的空间精度各项同性的针对样本的三维立体信息进行高光谱分辨，并实现这种荧光多维度定量成像技术和系统。此技术和系统装置可广泛应用于基础生物学、免疫生物学、解剖结构生物学、脑科学、医学研究及药物开发等领域，是一种新型的针对完整生物医学系统样本的多维度测量技术，可发展为现代生命科学和医学药学研究的重要研究工具。

为解决上述问题，本发明提供以下技术方案：一种高光谱分辨的扫描激光光学层析成像方法的系统，包括激光器、反射镜M1、反射镜M2、反射镜M3、扫描振镜、旋转台、透镜L1、透镜L2、透镜L3、透镜L4、荧光滤波片、色散原件、探测器1、探测器2、探测器3、计算机；

探测器1、探测器2、探测器3通过电气电路与计算机连接；

计算机与扫描振镜和旋转台连接；

透镜L3、透镜L4、荧光滤波片组成一个能选取一个特定波长的成像系统，荧光滤波片用于选取特定的波长；

激光器发出激光，通过反射镜M1，反射镜M2将激光打入扫描振镜，通过扫描振镜的反射再通过透镜L1聚焦到位于旋转台下的样本上；激光通过样本吸收后剩余的激光通过探测器3，计算机根据指令进行采集；激光通过样本后产生的荧光可以通过半透半反镜BS，半透半反镜BS将荧光的一半经过透镜L3，荧光滤波片，透镜L4打入探测器2后，计算机根据指令进行采集；荧光的另一半经过透镜L2聚焦到色散原件进行光谱信号的分辨，再根据计算机的指令利用探测器1进行光谱信号的采集；

计算机发出指令触发扫描振镜做快速二维横向扫描，从而对样本在每个角度下进行扫描，并得到吸收光或者荧光的强度投影图像和光谱分辨信息投影图像；

计算机发出指令控制触发旋转台步进角度，重复上述步骤最终得到角度相关的一系列吸收光荧光的强度投影图像和光谱分辨信息投影图像；

计算机对采集的信息进行数据解构后，再利用多角度的投影信号通过直线投影层析重建成像，最后可得到样本的三维立体强度信息和样本的高光谱三维立体信息；

其中，计算机发出指令，实现扫描控制、旋转台控制、探测器触发、曝光控制、信号采集和存储功能；计算机与探测器1、探测器2、探测器3连接，并通过触发电路与扫描振镜和旋转台连接。

附图说明

图1为本发明的体系结构图；

图2为本发明的工作流程图；

图3为本发明的另一实施例的体系结构图；

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下：

具体实施例1：

本发明公开了一种高光谱分辨的扫描激光光学层析成像方法的系统。利用点扫描的激光激发样本得到荧光，通过对单点发出的荧光进行高光谱成像，进行光谱分辨；利用扫描系统对样本进行二维的横向扫描，结合旋转台对样本进行旋转，得到在各个角度下高光谱分辨的二维投影图像，通过对这些各个角度下的投影图像进行重组运算，实现对样本三维立体信息的高光谱分辨。

本发明涉及一种对样本进行高光谱分辨的扫描激光光学层析成像方法及系统装置，包括激光器、反射镜M1、反射镜M2、反射镜M3、扫描振镜、旋转台、透镜L1、透镜L2、透镜L3、透镜L4、荧光滤波片、色散原件、探测器1、探测器2、探测器3、计算机；探测器1、探测器2、探测器3通过电气电路与计算机连接；计算机与扫描振镜和旋转台连接；透镜L3、透镜L4、荧光滤波片组成一个能选取一个特定波长的成像系统，荧光滤波片用于选取特定的波长；

成像方法包括：(1)点扫描的激光入射到样本上，获得荧光信号；(2)通过色散原件和探测器接受单点荧光的光谱信息；(3)操控激光进行二维的横向扫描；(4)操控旋转台进行角度旋转；(5)计算机对光谱信息进行数据解构后，再利用多角度的投影信号通过直线投影层析成像；所述装置由激光器、色散原件、探测器、旋转台、激光扫描系统、外触发信号源、数据采集卡、计算机组成；探测器、数据采集卡、计算机依次电气连接；外触发信号源与探测器、数据采集卡连接，并通过触发电路与激光扫描系统和旋转台连接；

激光器发出激光，通过反射镜M1，反射镜M2将激光打入扫描振镜，通过扫描振镜的反射再通过透镜L1聚焦到位于旋转台下的样本上；激光通过样本吸收后剩余的激光通过探测器3，计算机根据指令进行采集；激光通过样本后产生的吸收荧光可以通过半透半反镜BS，半透半反镜BS将吸收荧光的一半经过透镜L3，荧光滤波片，透镜L4打入探测器2后，计算机根据指令进行采集；另一半的吸收荧光经过透镜L2聚焦到色散原件进行光谱信号的分辨，再利用探测器1根据计算机的指令进行光谱信号的采集；

计算机发出指令触发扫描振镜做快速二维横向扫描，从而对样本在每个角度下进行扫描，并得到吸收荧光的强度投影图像和光谱分辨信息投影图像；

计算机发出指令控制触发旋转台步进角度，重复上述步骤最终得到角度相关的一系列吸收荧光的强度投影图像和光谱分辨信息投影图像；

计算机对采集的信息进行数据解构后，再利用多角度的投影信号通过直线投影层析重建成像，最后可得到样本的三维立体强度信息和高光谱的三维立体信息；

其中，计算机发出指令，实现扫描控制、旋转台控制、探测器触发、曝光控制、信号采集和存储功能；计算机与探测器1、探测器2、探测器3连接，并通过触发电路与扫描振镜和旋转台连接。

本发明成像高效快速，系统紧凑，操作方便，成像精度各向同性，可对样本进行三维立体信息的光谱分辨，适用于对样本进行结构和功能分析。尤其可以对完整地生物组织系统样本提供三维立体的光谱信息，光子利用率高，几乎无光毒性和光漂白，同时可对结构信息和功能信息做探测，可作为基础生物学医学药学研究的重要研究工具，例如研究形态发育和胚胎形成，器官发育，解剖结构组织形态，植物和海洋生物的结构特性和功能特性等。

具体实施例2：

如图2的工作流程和图3的结构示意图，其中探测器2为荧光强度探测器，探测器3为吸收强度探测器，此两路光学可根据需求加入或者取消。

此装置结合SLOT投影成像系统和光谱分辨系统，通过系统硬件操控平台，实现吸收(3)/荧光(2)/荧光光谱(1)相关数据采集。如上图实验装置所示，其中2路和3路可根据需求增减。

(1)激光器(e.g.488nm，200mw的半导体激光器)作为成像的激发光源，在光路中，将激光聚焦到样品上，且通过扫描系统(e.g.二维扫描振镜2-D Scanning Mirror)做快速二维横向扫描。样品所发出的荧光进入光谱分辨系统(e.g.色散原件或者光谱仪)，进行光谱分辨然后送入到探测器(e.g.CCD探测器或者阵列探测器或者sCMOS探测器)；也可以通过2路成像光学收集，送入探测器2(e.g.Photo-multiplier Tube)进行荧光强度的收集；还可以通过3号光路将吸收光送入探测器3(e.g Photon Detector)中进行吸收信号收集。

(2)在每个角度的强度/光谱投影图像是由激光扫描系统控制进行扫描(x,y)形成。

(3)通过旋转台步进角度，重复上述步骤最终得到角度相关的一系列强度投影图像(x,z,θ)/光谱信息投影图像(x,y,λ,θ)；

其中，利用实验装置的硬件操控平台(e.g.Labview或者Micromanager编写的硬件控制程序)，实现上述扫描控制、旋转台控制、探测器触发、曝光控制、信号采集及存储等功能。外触发信号源与探测器、数据采集卡连接，并通过触发电路与激光扫描系统和旋转台连接。

此装置结合SLOT投影成像系统和光谱分辨系统，通过计算机对触发电路、扫描振镜、旋转台和各个探测器进行控制，从而实现相关数据采集。所述激光器产生点扫描的激光，通过反射镜M1、反射镜M2、扫描振镜、入射到旋转台上的样本上，获得荧光信号；荧光信号通过色散原件进行光谱分辨，产生带有光谱分析的信号，计算机通过指令让探测器1采集接受荧光信号产生带有光谱分析的信号；

计算机操控扫描振镜进行二维的横向扫描；

计算机操控旋转台进行角度旋转；

计算机对光谱信息进行数据解构后，再利用多角度的投影信号通过直线投影层析成像；

其中探测器2为荧光强度探测器，探测器3为吸收强度探测器，此两路光学可根据需求加入或者取消。

此装置结合SLOT投影成像系统和光谱分辨系统，通过系统硬件操控平台，实现吸收(3)/荧光(2)/荧光光谱(1)相关数据采集。如上图实验装置所示，其中2路和3路(光路)可根据需求增减。

激光器(488纳米，200毫瓦的半导体激光器)作为成像的激发光源，在光路中，将激光聚焦到样本上，且通过扫描系统(二维扫描振镜2-D Scanning Mirror)做快速二维横向扫描。样本所发出的荧光进入光谱分辨系统(色散原件或者光谱仪)，进行光谱分辨然后送入到探测器(CCD探测器或者阵列探测器或者sCMOS探测器)；也可以通过2路成像光学收集，送入探测器2(Photo-multiplier Tube)进行荧光强度的收集；还可以通过3号光路将吸收光送入探测器3(Photon Detector)中进行吸收信号收集。

在每个角度的强度/光谱投影图像是由激光扫描系统控制进行扫描(x,y)形成。

通过旋转台步进角度，重复上述步骤最终得到角度相关的一系列强度投影图像(x,z,θ)/光谱信息投影图像(x,y,λ,θ)；

其中，利用实验装置的硬件操控平台(Labview或者Micromanager编写的硬件控制程序)，实现上述扫描控制、旋转台控制、探测器触发、曝光控制、信号采集及存储等功能。外触发信号源与探测器、数据采集卡连接，并通过触发电路与激光扫描系统和旋转台连接。

设计优点主要有：本发明有机结合高光谱分辨成像和扫描激光光学层析成像，光子利用效率高，具有对样本进行多维度荧光成像的快速高效成像的优点，三维立体的成像精度各向同性，成像系统紧凑，使用方便等优点。