一种烟草中倍半萜类化合物的测定方法与流程

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及烟草中倍半萜类化合物的测定方法。

背景技术：

吸烟是亿万烟民文化生活中不可缺少的部分，更是国家和地方财税的重要来源。虽然吸烟有害健康已得到广泛认可，但烟草仍然对成千上万的消费者有着强大的吸引力，除尼古丁的成瘾性外，烟草中丰富的香味物质也发挥着重要作用。

烟草中的香气成分一直是国内外研究热点，在国外研究烟草香气成分主要集中在上世纪70年代，瑞典学者Hlubucek J.R等采用植物化学的方法从烟草中分离到一系列的新化合物，这些研究成果在《Acta Chemica Scandinavica》、《Phytochemistry》、《Journal of Nature Product》等刊物发表了一系列的研究论文；所鉴定的化合物中就包含不少挥发性、半挥发性香气成分。《Chemical Reviews》还对该领域进行过评述。该期间最有代表性的研究成果是1976年Lioyd.R.A等从混合烤烟烟丝精油中鉴定出12类323种化合物，其中175种是在烤烟中首次发现的，有132种是以前文献未报道过的新化合物；该研究奠定了烤烟烟叶的香味物质基础。随着分析仪器的发展，烟草香气成分的研究转移到气相色谱-质谱(GC-MS)分析上。GC-MS具备GC的高分离效率和MS强大的定性和定量能力，成为了烟草香气成分分析的有力工具并在烟草行业得到广泛应用。

倍半萜类化合物是一种烟草中重要的倍半萜类化合物香气成分，广泛存在于烤烟烟叶、白肋烟烟叶、香料烟烟叶中。该成分具有优雅的香味，还能驱避昆虫。它是肥皂、化妆品和香水常用的成分。准确地对烟草中倍半萜类化合物进行测定，对评价烟草质量，识别烟草的风格特征均具有积极作用。我们通过凝胶净化样品，GC-MS分析，建立了一种烟草中重要倍半萜类化合物成分倍半萜类化合物测定的方法，目前该方法还未见相关文献报到。

技术实现要素：

本发明的目的在于第一方面提供一种烟草中倍半萜类化合物的测定方法，包括样本采制备、凝胶柱层析净化和GC-MS分析，具体包括以下步骤：

A、样品提取：用有机溶剂浸泡烟叶粉末，提取样品；提取方法可选择加热回流提取、超声提取、震荡萃取、索氏提取中的一种；

B、凝胶柱层析净化：将步骤A提取的样品用凝胶柱层析净化，收集含所述倍半萜类化合物的洗脱部分并进行浓缩；

C、将步骤B经凝胶柱层析净化并浓缩后的样品用气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析，采用选择离子检测，通过和对照品峰面积比较确定所述倍半萜类化合物的含量。色谱柱为DB-5MS(60m×0.25mm i.d×0.32μm d.f)熔融石英毛细管柱；载气及压力：He，85KPa；进样口温度：250℃；传输线温度：260℃；升温程序：50℃(5min)，3℃/min→240℃(5min)，2℃/min→250℃(30min)；进样量：1.0μL；分流比：1：25；电离方式：EI；离子源温度：180℃；电离能：70eV；扫描质量范围：50～300amu，扫描间隔0.5s；采集模式：选择离子(SI)模式，m/z 108、199和218。在该条件下倍半萜类化合物的色谱图见图-1，质谱图见图-2。

优选地，步骤A所述的有机溶剂为丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一种。烟叶一般粉碎到50～80目，取0.5～1.0g的样品，用10～20mL的丙酮、乙醇或乙酸乙酯提取，提取方法为回流提取20min，或超声提取30min，或震荡萃取40min，或索氏提取30min。提取液浓缩到0.25～0.5mL，供后续的凝胶柱层析净化用。

优选地，步骤B所述的凝胶为葡聚糖凝胶或聚苯乙烯树脂的一种。凝胶为SephadexLH-20葡聚糖凝胶或聚苯乙烯树脂中的一种，凝胶柱的装填规格为0.6×150mm，装柱溶剂为丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一种，和上述装柱溶剂相匹配。装好柱后把上述浓缩好的样品加到凝胶柱上，用丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一种洗脱(洗脱溶剂和装柱溶剂相匹配)，收集10～11倍柱体积的洗脱馏分，再次浓缩到0.25～0.5mL供GC-MS分析用。

优选地，步骤B所述的凝胶柱的柱长与柱径的比例为25:1。

优选地，步骤B所述的收集含所述倍半萜类化合物的洗脱部分的体积为10～11倍柱体积。

优选地，步骤C中的条件如下：色谱柱为DB-5MS熔融石英毛细管柱，其规格为60m×0.25mm i.d×0.32μm d.f；载气及压力：He，85KPa；进样口温度：250℃；传输线温度：260℃；升温程序：50℃，5min；3℃/min→240℃，5min；2℃/min→250℃，30min；进样量：1.0μL；分流比：1：25；电离方式：EI；离子源温度：180℃；电离能：70eV；扫描质量范围：50～300amu，扫描间隔0.5s；采集模式：选择离子模式，m/z 108、199和218。

本发明第二方面提供所述的测定方法用于评价烟草风格和烟草质量的用途。

本发明的有益效果：

1、本发明建立了一种烟草中倍半萜类化合物香气成分倍半萜类化合物的测定方法，方法线性范围宽、灵敏度高，可满足烟草中不同含量倍半萜类化合物测定的要求；而且方法回收率高、精密度好，可实现烟草中倍半萜类化合物含量的准确测定，为烟草质量评价和香型风格识别提供了可靠的新方法。

2、本方法采用凝胶柱层析净化样品，凝胶净化是基于体积排阻效应原理，根据化合物分子大小不同而达到分离净化的目的；可实现样品中和倍半萜类化合物分子量有差异的共存成分的分离，样品净化效果好。和常用的同时蒸馏萃取法比较，本发明操作更简单，而且样品前处理过程中待测成分损失少，分析结果的精密度和回收率均有提高。

3、倍半萜类化合物含量和感官评吸结果有明显的相关性，倍半萜类化合物含量测定可作为烟叶质量评价的标志化合物。采用本发明所建立的测定方法可用于评价烟草风格和烟草质量的用途。

附图说明

图1：本发明的倍半萜类化合物的GC-MS选择离子色谱图；

图2：本发明的倍半萜类化合物的质谱图。

图3：本发明的倍半萜类化合物的凝胶净化洗脱曲线；

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明要求所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述倍半萜类化合物的检测方法，包括样本制备、凝胶柱层析净化和GC-MS分析、具体包括：

A、样本制备：为了获得均匀而有代表性的样品，烟叶样品每样取500g，粉碎到50～80目，供随后的分析用。样品分析时每样取0.5～1.0g的，由于倍半萜类化合物在丙酮、乙醇或乙酸乙酯均具有较好的溶解度，样品提取溶剂可采用丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一种；用10～20mL的丙酮、乙醇或乙酸乙酯提取，采用回流提取20min可提取完全，采用超声提取30min可提取完全，采用震荡萃取40min可提取完全，采用索氏提取30min可提取完全，提取方法可以采用上述方法的任意一种。提取完全后，提取液浓缩到0.25～0.5mL，可供后续的凝胶柱层析净化用。

B、凝胶柱层析净化：凝胶净化是基于体积排阻效应原理，根据化合物分子大小不同而达到分离净化的目的；由于倍半萜类化合物和烟草中共存物存在分子量差异，可通过凝胶净化和和共存物分离而达到样品净化。实验用凝胶为Sephadex LH-20葡聚糖凝胶或聚苯乙烯树脂中的一种，凝胶柱的装填规格为0.6×150mm，用丙酮、乙醇或乙酸乙酯装填对净化效果均没有影响，因此装柱溶剂可选择丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一种。装好柱后把上述浓缩好的样品加到凝胶柱上，可用洗脱剂洗脱；由于凝胶分离效果主要由柱材料决定，洗脱剂影响很小，因此，洗脱剂可用丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一种洗脱，倍半萜类化合物的洗脱曲线见图-3，当洗脱液的体积达43.5mL时倍半萜类化合物从开始出峰，45.6mL完全洗脱下，为了避免保留时间波动而导致馏分损失，收集42.4mL～46.6mL之间的部分馏分，约10～11倍柱体积的洗脱馏分。所收集的馏分浓缩到0.25～0.5mL供GC-MS分析用。

C、GC-MS分析：对气相色谱分析条件进行了优化，最终选定色谱条件为：DB-5MS(60m×0.25mm i.d×0.32μm d.f)熔融石英毛细管柱；载气及压力：He，85KPa；进样口温度：250℃；传输线温度：260℃；升温程序：50℃(5min)，3℃/min→240℃(5min)，2℃/min→250℃(30min)；进样量：1.0μL；分流比：1：25；在该条件下，倍半萜类化合物能得到很好的分离，见图-2。

质谱检测采用电离方式为EI源；离子源温度：180℃；电离能：70eV；扫描质量范围：50～300amu，扫描间隔0.5s；根据质谱图，倍半萜类化合物在m/z 108、199和218有丰度高的质谱峰，因此采用选择离子(SI)采集模式，选择的离子为m/z 108、199和218。

D、方法的灵敏度、回收率和重现性：在选定的实验条件下，倍半萜类化合物的在1.0～120ng/L内具有很好的线性关系，工作曲线为A＝12.84C+3.26，相关系数为0.9994；根据信噪比S/N＝3确定倍半萜类化合物的检测限为0.28ng/L，根据信噪比S/N＝10确定倍半萜类化合物的检测限为1.0ng/L，丰富具有很高的灵敏度，能满足烟草中痕量倍半萜类化合物测定的要求；采用2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL三个浓度进行了回收率实验，倍半萜类化合物的回收率在94.5～103.2％之间，方法具有很好的回收率。对同一样品进行7次平行测定(同一天内同一批次进行)，倍半萜类化合物测定结果的RSD为3.3％，在不同时间内(隔天测定因此)对样品进行7次平行测定，倍半萜类化合物的RSD为4.2％，说明方法均有很好的日内和日间精密度。

E、烟草中倍半萜类化合物含量和烟草风格、烟草品质相关性：采用所建立的方法对于清香、浓香、中间香三种风格的24个烟叶中倍半萜类化合物含量进行类分析，三种烟叶中倍半萜类化合物含量为，清香>中间>香浓香，说明倍半萜类化合物含量和烟草风格有明显的相关性，可作为烟草风格识别的标志性化合物。对24种不同感官评吸结果的烟叶进行了倍半萜类化合物测定，结果表明倍半萜类化合物含量和感官评吸结果有明显的相关性，倍半萜类化合物含量测定可作为烟叶质量评价的标志化合物。

下面仅以倍半萜类化合物香气成分倍半萜类化合物的测定对本发明做进一步说明：

实施例1

选取烤烟烟叶，准确称取样品1.0g，加入20mL的乙酸乙酯回流提取20min，提取液浓缩到0.5mL，添加到装填好的凝胶柱上(材料为葡聚糖凝胶，凝胶柱的装填规格为0.6×150mm，装柱溶剂为乙酸乙酯)，加过样的凝胶柱用乙酸乙酯洗脱，收集10～11倍柱体积的洗脱馏分再次浓缩到0.5mL；按选定的色谱条件和质谱条件测定，倍半萜类化合物倍半萜类化合物的含量为6.26μg/g。

实施例2

选取香料烟烟叶，准确称取样品0.50g，加入20mL的丙酮回流提取20min，提取液浓缩到0.5mL，添加到装填好的凝胶柱上(材料为葡聚糖凝胶，凝胶柱的装填规格为0.6×150mm，装柱溶剂为丙酮)，加过样的凝胶柱用丙酮洗脱，收集10～11倍柱体积的洗脱馏分再次浓缩到0.5mL；按选定的色谱条件和质谱条件测定，倍半萜类化合物倍半萜类化合物的含量为11.2μg/g。

实施例3

选取样品为白仂烟烟叶，准确称取样品1.0g，加入20mL的乙醇回流提取20min，提取液浓缩到0.5mL，添加到装填好的凝胶柱上(材料为葡聚糖凝胶，凝胶柱的装填规格为0.6×150mm，装柱溶剂为乙醇)，加过样的凝胶柱用乙醇洗脱，收集10～11倍柱体积的洗脱馏分再次浓缩到0.5mL；按选定的色谱条件和质谱条件测定，倍半萜类化合物倍半萜类化合物的含量为4.26μg/g。