一种可视化快速检测汞离子的掺杂多孔碳银纳米粒子的制作方法

本发明属于材料技术领域，涉及一种掺杂多孔碳银纳米粒子，具体涉及一种与汞离子共存具有高氧化模拟酶活性的多孔碳掺杂银纳米粒子，可直接应用于食品、环境样品中痕量汞离子的可视化快速检测。

背景技术：

汞是一种应用广泛的重金属，常见的汞气灯、电池、水银温度计、油漆、农药、杀虫剂、牙科汞齐、治疗疥癣药物和恶疮的原料等不同程度含汞。这些产品在生产过程和用完后处理不当，易造成汞污染。汞严重损害中枢神经系统，表现出如下症状：震颤、神经精神症状、中毒性肾病及口腔炎。此外，还会影响人的神经系统、免疫系统和消化系统，严重损害人的肺部、肾脏和大脑。因此，对环境、食品、动植物体、药物中汞的检测极其重要。

汞含量测定的方法一般有电化学法、微波辅助萃取－高效液相色谱－电感偶和等离子质谱法、原子荧光光谱法等(B Kuswandi,et al.Analytica ChimicaActa,2007,591(2):208-213；邱天宇,等.电化学,2016,22(1):20-24；张兰,等.环境化学,2013,32(11):2219-2222；陈绍华,等.皮革科学与工程,2016,26(1):69-72.)。这些方法检出限低，但分析时间长，需要复杂的样品前处理，所用仪器昂贵，成本比较高，不适于现场和基层实验室推广应用。

比色传感器由于颜色变化可以肉眼辨别，不需要昂贵的仪器，具有成本低，操作简单、快速，灵敏度高，适于现场分析等特点而受到青睐，特别是基于纳米材料的新型比色传感器。目前报道的基于纳米材料的汞比色传感器较多，如Liu等基于单链DNA修饰的金纳米粒子在汞离子存在时发生团聚，溶液的颜色由红变蓝，建立一种检测水中痕量汞离子的方法，检出限250nM(Liu C W,et al.Chem.Commun.,2008,2242-2244)，但方法的选择性和灵敏度低，所用试剂氯金酸，价格昂贵。Li等基于富含T碱基的G-四分体DNA酶与卟啉铁(hemin)形成的配合物具有类辣根过氧化酶的性质，能催化ABTS与H₂O₂反应生成蓝绿色产物，当体系中存在汞离子，G-四分体DNA酶与汞离子特异性结合形成T-Hg²⁺-T稳定结构，导致卟啉铁(hemin)无法催化ABTS氧化H₂O₂从而实现对汞的比色检测(Li T,et al.,Chem.Commun.,2009,3551-3553)，方法的选择性高，富含T碱基的G-四分体DNA酶，制备复杂，成本高。Zhang等人合成一种磁性复合材料Au@Fe₃O₄@GO,该材料在Hg²⁺存在时能催化TMB与H₂O₂反应生成蓝色产物，Hg²⁺检出限达0.15nM(Zhang S,et al.Nanoscale,2015,45(7):8495-8502)，该方法灵敏度和选择性高，但所用的材料和试剂涉及氯金酸、石墨烯，成本高，限制了其推广应用。为降低成本，Annadhasan M等人采用酪氨酸为稳定剂和还原剂，合成的银纳米粒子，比色检测汞离子，检出限16nM(Annadhasan M,et al.ACS Sustainable Chemistry&Engineering,2014,2(4):887-896.)；Shen Z等在木质素的碱性溶液中采用微波辐射合成银纳米粒子，比色检测汞离子，检出限23nM(Shen Z,et al.ACS Applied Materials&Interfaces,2014,6(18):16147-16155.)，但以上方法的选择性不够高。Yang等基于纳米氧化锰具有类辣根过氧化酶的性质，能催化TMB与H₂O₂反应生成蓝色产物，而谷光氨肽能阻止纳米氧化锰催化TMB与H₂O₂反应使蓝色消失，当汞离子存在时，因汞离子与谷光氨肽配位，能够恢复纳米氧化锰的催化活性，使溶液蓝色恢复，从而构建汞离子检测方法，检出限80nM(Yang H,et al.Angew Chem Int Ed,2009,48(13):2308.)，但该方法不够简便，灵敏度不够高，且方法中使用的H₂O₂不稳定，影响了结果的重现性和准确度。徐秀芳以柠檬酸三钠为稳定剂，NaBO₄为还原剂制备银纳米粒子，制备的银纳米粒子在汞离子存在时能催化溶液中的溶解氧氧化TMB生成蓝色产物，建立了痕量汞比色检测方法，检出限为28nM(徐秀芳.纳米材料模拟酶及其分析应用[D].江苏：江南大学,2014.)，该方法避免了不稳定且有破坏性的过氧化氢的使用，但灵敏度和选择性有待进一步提高。

技术实现要素：

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种简便快速，灵敏度和选择性高的可视化快速检测痕量汞离子的掺杂多孔碳银纳米粒子，发明的掺杂多孔碳银纳米粒子制备方法简单，分散性稳定性好，与汞离子共存具有高氧化酶活性，可广泛地应用于食品、环境样品中痕量汞离子的快速检测。

本发明所述的掺杂多孔碳的银纳米粒子DHPC@CS-AgNPs，是通过以下步骤来制备的：(1)在250mL三颈烧瓶中依次加入去离子水、甲基丙烯酸甲酯和催化剂，开启冷却水，通氮气，搅拌，水浴反应1～2h，得到聚甲基丙烯酸甲酯乳液(PMMA)。(2)在PMMA乳液中依次加入蔗糖和聚吡咯，搅拌，再加入1mL H₂SO₄，原位自组装反应20min。所得产物倒入培养皿，于干燥箱中干燥。将干燥的产物转移至坩埚置于管式炉中，在氮气气氛下烘烧6h，然后炭化3h，得到大孔碳。(3)将大孔碳分散于5mL丙酮，加入20mL KOH溶液，搅拌，水浴反应至形成浆状混合物。将浆状混合物置于管式炉，在氮气保护下高温活化。活化产物用蒸馏水洗涤至中性，真空干燥，得到多孔碳(DHPC)。(4)将壳聚糖(CS)溶于100mL 1％醋酸溶液中，然后加入DHPC，超声分散，过滤，得到掺杂多孔碳的壳聚糖溶液(DHPC@CS)。(5)将0.02g NaBH₄加入DHPC@CS溶液，搅拌均匀，然后缓慢滴加0.6mmol·L^-1AgNO₃溶液，室温反应，得到掺杂多孔碳的银纳米粒子DHPC@CS-AgNPs。

本发明先通过甲基丙烯酸甲酯本体聚合制备有机玻璃乳液(聚甲基丙烯酸甲酯)，再以有机玻璃乳液为模板，蔗糖和聚吡咯为碳源，硫酸为催化剂，通过原位自组装、干燥、炭化得到大孔碳，再经碱液处理得到多孔碳；然后将多孔碳超声分散于壳聚糖溶液，以硼氢化钠为还原剂，通过缓慢滴加硝酸银得到掺杂多孔碳的银纳米粒子DHPC@CS-AgNPs。该粒子制备方法简单，反应条件温和，分散稳定性好，与Hg²⁺共存具有高的氧化模拟酶活性，能用于快速、灵敏、选择性地比色检测食品和环境样品中痕量Hg²⁺。检测方法可视，仪器设备简单，快速灵敏，选择性高，适于基层实验室推广应用，可广泛地应用于食品、环境样品中痕量Hg²⁺的可视化快速分析。

本发明所述的掺杂多孔碳银纳米粒子具有以下有益效果：

(1)制备方法简单，反应条件温和，分散稳定性好(掺杂多孔碳的银纳米粒子呈均匀透明的溶液状态，放置一周不会发生沉淀，一周后用于催化反应，其催化溶液的吸光值与一周前的吸光值基本一致)；

(2)具有氧化酶活性，Hg²⁺存在时，催化活性高(氧化TMB的米氏常数和最大反应速度为K_m＝0.0165mM，V_max＝4.6512x10^-8M/s)；

(3)能快速灵敏，高选择性比色检测食品和环境样品中痕量Hg²⁺(掺杂多孔碳的银纳米粒子只有与汞离子共存，才具有氧化模拟酶活性，检出限达7.0×10^-9mol/L)

(4)检测方法可视快速，操作简单，方便推广应用。

附图说明

图1是本发明所述的掺杂多孔碳银纳米粒子的制备原理图。

图2是本发明所述的多孔碳纳米粒子的扫描电镜图。图中，A是大孔碳；B是大孔碳经碱液处理所得的多孔碳。

图3是本发明所述的掺杂多孔碳银纳米粒子的氧化酶活性实验结果图。图中，A曲线是Hg²⁺+TMB；B曲线是DHPC@CS-AgNPs+TMB；C曲线是Hg²⁺+DHPC@CS-AgNPs+TMB。

图4是本发明所述的掺杂多孔碳银纳米粒子与汞离子共存(Hg²⁺+DHPC@CS-AgNPs+TMB)的稳态动力学参数测定结果图。

图5是本发明所述的掺杂多孔碳的银纳米粒子用于比色检测痕量Hg²⁺的原理图。

图6是本发明所述的掺杂多孔碳银纳米粒子用于比色检测痕量Hg²⁺的选择性结果图。

图7是本发明所述的掺杂多孔碳银纳米粒子用于比色检测痕量Hg²⁺的标准曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不限制于这些实施例。

实施例1：本发明所述的快速检测汞离子的掺杂多孔碳银纳米粒子的制备。

本实施例所述的快速检测汞离子的掺杂多孔碳银纳米粒子的制备原理图如图1所示，制备方法包括以下步骤：

(1)在250mL三颈烧瓶中依次加入100mL去离子水、20mL甲基丙烯酸甲酯和0.04g过硫酸钾，开启冷却水，通氮气，在350r/min机械搅拌下，90℃水浴反应1h，得到聚甲基丙烯酸甲酯乳液(PMMA)。(2)在20g PMMA乳液中依次加入0.5g蔗糖和0.1g聚吡咯，以350r/min机械搅拌15min，再加入1mL 0.5mol/L H₂SO₄，原位自组装反应15min。所得产物倒入培养皿，于60℃干燥箱中干燥6h。将干燥的产物转移至坩埚置于管式炉中，在氮气气氛下150℃烘烧6h，然后900℃炭化3h，得到大孔碳。(3)将0.5g大孔碳分散于5mL丙酮，加入20mL 0.1g/mL KOH溶液，磁力搅拌，100℃水浴反应至形成浆状混合物。将浆状混合物置于管式炉，在氮气保护下200℃活化。活化产物用蒸馏水洗涤至中性，70℃真空干燥24h，得到多孔碳(DHPC)。(4)将0.1g壳聚糖(CS)溶于100mL 1％醋酸溶液中，然后加入0.1g DHPC，超声分散4h，过滤，得到掺杂多孔碳的壳聚糖溶液(DHPC@CS)。(5)将0.02g NaBH₄加入60mL DHPC@CS溶液，磁力搅拌混合均匀，然后缓慢滴加30mL 0.6mmol·L^-1AgNO₃溶液，室温反应20h，得到掺杂多孔碳的银纳米粒子DHPC@CS-AgNPs。

实施例2：本发明所述的快速检测汞离子的掺杂多孔碳银纳米粒子的制备。

本实施例所述的快速检测汞离子的掺杂多孔碳银纳米粒子的制备原理图如图1所示，制备方法包括以下步骤：

(1)在250mL三颈烧瓶中依次加入120mL去离子水、20mL甲基丙烯酸甲酯和0.08g过硫酸钾，开启冷却水，通氮气，在500r/min机械搅拌下，90℃水浴反应2h，得到聚甲基丙烯酸甲酯乳液(PMMA)。(2)在30g PMMA乳液中依次加入0.75g蔗糖和0.15g聚吡咯，以350r/min机械搅拌20min，再加入1mL 1.0mol/L H₂SO₄，原位自组装反应20min。所得产物倒入培养皿，于70℃干燥箱中干燥8h。将干燥的产物转移至坩埚置于管式炉中，在氮气气氛下200℃烘烧6h，然后950℃炭化3h，得到大孔碳。(3)将1.0g大孔碳分散于10mL丙酮，加入40mL 0.2g/mL KOH溶液，磁力搅拌，100℃水浴反应至形成浆状混合物。将浆状混合物置于管式炉，在氮气保护下200℃活化。活化产物用蒸馏水洗涤至中性，80℃真空干燥20h，得到多孔碳(DHPC)。(4)将0.05g壳聚糖(CS)溶于50mL 1％醋酸溶液中，然后加入0.05g DHPC，超声分散4h，过滤，得到掺杂多孔碳的壳聚糖溶液(DHPC@CS)。(5)将0.02g NaBH₄加入70mL DHPC@CS溶液，磁力搅拌混合均匀，然后缓慢滴加28mL 0.6mmol·L^-1AgNO₃溶液，室温反应24h，得到掺杂多孔碳的银纳米粒子DHPC@CS-AgNPs。

实施例3：本发明所述的多孔碳(DHPC)纳米粒子的多孔性。

扫描电镜检测：将实施例1制备得到的多孔碳(DHPC)纳米粒子通过扫描电镜进行观察，如图2所示，制备得到的大孔碳(图2A)孔径较大，孔分布均匀；经碱液活化处理后所得多孔碳(图2B)表面光滑，孔径明显变小，有大孔、微孔和介孔，以微孔为主，比表面积大，经计算得到的BET表面积为840cm²/g，总孔体积为2.1cm³/g。

实施例4：本发明所述的DHPC@CS-AgNPs纳米粒子在汞离子存在时的氧化酶活性。

选择实施例1所制备的DHPC@CS-AgNPs纳米粒子进行氧化酶活性试验。

分别往A、B、C号比色管中加入1mL 0.05mol·L^-1NaAc-HAc缓冲溶液(pH＝4.0)和300μL 400mmol·L^-1的TMB溶液，再分别往B、C号比色管中加入500μL 0.18mmol·L^-1DHPC@CS-AgNPs，然后再分别往A、C号比色管中加入500μL10^-6mol·L^-1Hg²⁺,最后用超纯水将A、B、C号比色管定容至5mL，在40℃恒温振荡培养箱中反应10分钟后进行紫外光谱扫描，结果如图3。A号比色管的溶液(Hg²⁺+TMB)为无色透明，在370nm到800nm之间几乎呈一条直线，说明Hg²⁺不能催化溶液中的溶解氧氧化TMB显色；B号比色管的溶液(DHPC@CS-AgNPs+TMB)呈现纳米银的黄色，在400nm左右出现纳米银的特征吸收峰，表明DHPC@CS-AgNPs不能催化溶液中的溶解氧氧化TMB显色，催化活性弱；C号比色管的溶液(Hg²⁺+DHPC@CS-AgNPs+TMB)为蓝色，说明Hg²⁺存在能促进DHPC@CS-AgNPs催化氧化TMB显色，显色后的TMB在370nm和652nm处有特征吸收峰，说明Hg²⁺+DHPC@CS-AgNPs具有氧化模拟酶活性。

实施例5：本发明所述的Hg²⁺+DHPC@CS-AgNPs氧化模拟酶的动力学参数。

采用实施例1所制备的DHPC@CS-AgNPs纳米粒子进行以下实验。

取500μL 0.18mmol·L^-1DHPC@CS-AgNPs和500μL 1×10^-6mol·L^-1Hg²⁺,加入300μL不同浓度(100～500μM)的TMB溶液，再加入1mL 0.05mol·L^-1NaAc-HAc缓冲溶液(pH＝4.0)，用超纯水定容至5mL，在652nm波长处测定其紫外吸光度，结果见表1。由表1测定结果，根据米氏方程以1/c_TMB对1/V作图得到图4的Lineweaver–Burk曲线。由图4的线性方程可以计算出Hg²⁺+DHPC@CS-AgNPs氧化模拟酶的米氏常数K_m＝0.0165mM，V_max＝4.65×10^-8M/s，说明Hg²⁺+DHPC@CS-AgNPs对TMB的亲和力和催化反应速率高，具有高的氧化模拟酶催化活性。

表1：测定的反应速率

实施例6：本发明所述的DHPC@CS-AgNPs纳米粒子用于比色检测汞离子的选择性。

采用实施例1所制备的DHPC@CS-AgNPs纳米粒子比色检测汞离子的原理见图5，实验步骤如下。

取500μL 0.18mmol·L^-1DHPC@CS-AgNPs和500μL 1×10^-6mol·L^-1Hg²⁺于5ml的比色管中，加入300μL 400mmol·L^-1的TMB溶液，再加入1mL 0.05mol·L^-1NaAc-HAc缓冲溶液(pH＝4.0)，用超纯水定容至5mL，在40℃振荡培养箱中反应10分钟，测定其在652nm的吸光度。在上述实验中分别以同浓度的Cu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺和500倍Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、Na⁺代替汞离子，考察方法的选择性(见图6)。结果发现，只有汞离子能使体系显蓝色，在TMB特征波长652nm处有最大吸收峰，表明碳掺杂的纳米银粒子对汞离子的比色检测具有特异选择性。

实施例7：本发明所述的DHPC@CS-AgNPs纳米粒子用于比色检测汞离子的灵敏度。

采用实施例1所制备的DHPC@CS-AgNPs纳米粒子比色检测汞离子的原理见图5，实验步骤如下。

取500μL 0.18mmol·L^-1DHPC@CS-AgNPs和500μL浓度分别为0.02、0.05、0.2、0.5、1μmol·L^-1的汞离子标准溶液于5ml的比色管中，加入300μL 400mmol·L^-1的TMB溶液，再加入1mL 0.05mol·L^-1NaAc-HAc缓冲溶液(pH＝4.0)，用超纯水定容至5mL，在40℃振荡培养箱中反应10分钟，测定其在652nm的吸光度。以测得的吸光度A对相应的汞离子标准溶液浓度c(μmol·L^-1)作图(图7)。汞离子浓度在0.02～1μmol·L^-1范围内与A呈良好的线性关系，线性回归方程为A＝0.332c+0.085，相关系数r²＝0.995，检出限(S/N＝3)为7nM，说明方法的灵敏度高。

实施例8：本发明所述的DHPC@CS-AgNPs纳米粒子应用于比色检测食品和环境样品中痕量汞离子。

采用实施例1所制备的DHPC@CS-AgNPs纳米粒子进行以下实验。

鱼样品的处理：称取2.0g样品于消解罐中，加入5mL浓硝酸，加盖放置过夜，拧紧盖子，放置微波消解仪中消解，冷却取出，慢慢打开盖子排气，用少量超纯水洗涤瓶盖，把消解罐放置超声水浴箱中超声2min排气，把消解液移至25mL的容量瓶中，定容至刻度。

水样的处理：用0.22μm的滤膜过滤，用0.05mol·L^-1醋酸-醋酸钠缓冲溶液调至pH＝4，在4℃下冷藏备用。取500μL样液按照2.5方法进行测试。

取500μL鱼样品溶液或水样于5ml的比色管中，依次加入500μL 0.18mmol·L^-1DHPC@CS-AgNPs，300μL 400mmol·L^-1的TMB溶液和1mL 0.05mol·L^-1NaAc-HAc缓冲溶液(pH＝4.0)，用超纯水定容至5mL，在40℃振荡培养箱中反应10分钟，测定样品溶液在652nm的吸光度。由测得的吸光度计算样品中汞离子的含量。鱼样品溶液和水样样品同时采用GB/T 5009.17-2014原子荧光法进行对照实验，结果见表2。采用本发明的方法，水样、鱼肉和鱼尾中均未检测出汞离子的含量，水样、鱼肉和鱼尾样品的加标回收率在91.6％～103％，相对标准偏差在2.6％～6.7％；采用GB/T 5009.17-2014原子荧光法，水样中未检测出汞离子的含量，鱼肉和鱼尾中检测出微量汞离子，含量在17.3～21.4μg·kg^-1，两种方法测得的结果相一致，表明本方法具有高的精确性和准确性，能应用于实际样品中痕量汞的检测。

表2：水样和鱼样中汞离子含量测定结果(n＝3)

“–”表示未检出。