本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及用于检测磷含量的试剂盒及测定磷含量的方法。
背景技术：
乳及乳制品中磷含量的测定主要依据食品安全国家标准GB 5413.22-2010《婴幼儿食品和乳品中磷的测定》，其原理为：试样经酸氧化，使磷在硝酸溶液中与钒钼酸铵生成黄色络合物。用分光光度计在波长440nm处测定吸光度，其颜色的深浅与磷的含量成正比。
然而，目前测定磷含量的方法仍有待改进。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供用于检测磷含量的试剂盒及测定磷含量的方法，由此，能够准确地测定磷含量，且能够实现快速、批量检测。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于检测磷含量的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：指示剂，所述指示剂为0.2体积％的对硝基酚溶液；显色剂，所述显色剂包括钼酸铵、偏钒酸铵、硝酸及水；以及调解液，所述调解液包括0.2mol/L硝酸溶液、6mol/L第一氢氧化钠溶液以及0.1mol/L第二氢氧化钠溶液。由此，根据本发明实施例的用于检测磷含量的试剂盒能够准确地测定磷含量，且能够实现快速、批量检测。
根据本发明的实施例，上述用于检测磷含量的试剂盒还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括：磷标准品溶液；以及多孔板。由此，根据本发明实施例的用于检测磷含量的试剂盒能够准确地测定磷含量，且能够实现快速、批量检测。
根据本发明的实施例，基于20mL所述显色剂，所述显色剂包括0.5g钼酸铵、0.025g偏钒酸铵、5mL硝酸以及15mL蒸馏水。由此，根据本发明实施例的用于检测磷含量的试剂盒能够准确地测定磷含量，且能够实现快速、批量检测。
需要说明的是，对于显色剂的提供形式不作严格限定，既可以将每种成分以独立的包装提供，需要使用时按照上述配比配置得到，也可以以混合液的形式提供，无需自行配置，直接使用即可。
还需要说明的是，调解液中各种溶液是分别以独立包装的形式提供的。
根据本发明的实施例，所述多孔板包括6孔板、24孔板或96孔板。由此，根据本发明实施例的用于检测磷含量的试剂盒能够准确地测定磷含量，且能够实现快速、批量检测。
发明人发现，国标GB5413.22-2010测定磷含量时，由于利用分光光度计测定吸光度，导致每批只能检测少量样品，无法完成样品的批量处理，效率低。此外，反应体系的体积较大，所需试剂量较多，造成浪费。根据本发明实施例的试剂盒包括多孔板，进而能够批量处理样品，节省时间和成本，提高效率。
发明人进一步发现，对于不同体积的反应体系，各反应物之间的相互作用并不完全相同，进而，并不能直接保持国标方法中各试剂浓度，仅将体积等比例缩小后直接用于本申请，否则将导致检测结果不准确。发明人经过大量实验优化得到试剂的浓度及比例关系，从而使得检测结果的准确性较高。
需要说明的是，本发明对磷标准品溶液的提供形式不作严格限定，既可以提供多个不同浓度的磷标准品溶液，直接将其应用于检测，以绘制浓度-吸光度标准曲线。具体地，不同浓度的磷标准品溶液分别以独立包装形式提供。还可以仅提供一个高浓度的磷标准品溶液，然后根据使用者的需要对其进行稀释，以便于绘制标准曲线。
根据本发明的实施例，所述用于检测磷含量的试剂盒进一步包括：高氯酸和硝酸。高氯酸和硝酸用于将样品进行消解。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种利用前面所描述的试剂盒测定磷含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用已知的方法对待测样品进行消解处理，并将所得到的消解产物冷却，得到预测液；将所述预测液转移至容量瓶中，向所述容量瓶中加入所述指示剂，用所述第一氢氧化钠溶液进行调节至溶液为黄色，再用所述硝酸溶液调节至溶液为无色，最后用所述第二氢氧化钠溶液调节至溶液为微黄色，并定容，得到待测液；分别将所述磷标准品溶液和待测液置于所述孔板中，向所述孔板中加入所述显色剂，混匀后静置，并将所述孔板置于酶标仪中进行检测；以及基于检测结果确定所述待测样品中磷含量。由此，根据本发明实施例的方法能够准确地测定磷含量，且能够实现快速、批量检测。
需要说明的是，对于待测样品的种类及来源不作严格限定，可以根据实际情况而定，既可以是固态样品，也可以是液态样品。具体地，可以为食品类物质。根据本发明的具体实施例，待测样品可以为乳制品。
根据本发明的实施例，基于1μL所述显色剂，所述磷标准品溶液及待测液的添加量均为0.5μL。由此，根据本发明实施例的方法能够准确地测定磷含量，且能够实现快速、批量检测。
发明人发现，本发明是在孔板中进行的，反应体积远远小于国标方法的反应体积。对于不同体积的反应体系，各反应物之间的相互作用并不完全相同，进而，并不能直接将国标方法的反应体积比(即待测液/标准品与显色剂的体积比)应用于本申请，否则将导致检测结果的准确性低。由此，发明人经过大量实验优化得到上述最优磷标准品溶液、待测液及显色剂的添加量。添加量过高或者过低都将影响检测结果的准确性。
此外，国标方法中将冷却的消解产物进行定容，再取10mL定容后的溶液于50mL容量瓶中调节pH值，而本发明的方法中直接将冷却的消解产物转移至容量瓶中，进行调节pH值，减少了定容步骤，进一步缩短了检测时间。
根据本发明的实施例，所述方法包括：
采用已知的方法对待测样品进行消解处理，并将所得到的消解产物冷却，得到预测液；
将所述预测液转移至容量瓶中，向所述容量瓶中加入0.10～0.15mL所述指示剂，用所述第一氢氧化钠溶液进行调节至溶液为黄色，再用所述硝酸溶液调节至溶液为无色，最后用所述第二氢氧化钠溶液调节至溶液为微黄色，并用水定容至100mL，得到待测液；
分别将100μL所述磷标准品溶液和100μL待测液置于所述96孔板中，向所述96孔板中加入200μL所述显色剂，混匀后静置10～15min，将所述96孔板置于酶标仪中，在440nm波长下测定吸光度；以及
根据所述磷标准品溶液的浓度和吸光度绘制标准曲线，并将所述待测液的吸光度代入所述标准曲线中，计算得到所述待测样品中的磷含量。
发明人经过大量实验发现，采用96孔板进行反应，能够同时检测大量的待测物质，极大地提高了检测效率。进一步地，发明人发现，在96孔板的检测条件下，所需的磷标准品溶液、待测液及显色剂添加量分别为100μL、100μL、200μL。在此条件下能够准确地测定磷含量。添加量过多或者过少都将影响检测结果的准确性。
此外，发明人发现，采用量程为100mL的容量瓶进行定容，更有利于检测。具体地，由于直接将消解产物进行定容，使得后续调节pH值所需要的调解液量偏多。若采用50mL量程的容量瓶，不容易混匀，且用氢氧化钠溶液调节时需要加入较多体积溶液，容易超出量程。进而，发明人经过大量实验发现，采用100mL量程的容量瓶，不仅能够快速地混匀调解液与消解产物，便于滴定，且不会超出量程，使得检测过程操作简便、快速。
由此，根据本发明实施例的方法能够准确地测定磷含量，且能够实现快速、批量检测。
根据本发明的具体实施例，“采用已知的方法对待测样品进行消解处理”的具体步骤如下：
称取0.5g固体试样或2.5g液体试样(精确至0.1mg)于125mL三角瓶中，放入几粒玻璃球，加10mL硝酸，然后放在电热板上加热。待剧烈反应结束后取下，稍冷却，再加入10mL高氯酸，重新放于电热板上加热。若消化液变黑，需取下再加入5mL硝酸继续消化，直到消化液变成无色或淡黄色，且冒出白烟，在消化液剩下3mL～5mL时停止消解处理。
需要说明的是，对于高氯酸和硝酸的来源不作严格限定，既可以通过市售获得，也可以由前面所描述的试剂盒提供。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法测定样品中磷含量。
1.1样品测定
1.1.1标准曲线的绘制
精确吸取100μL磷标准品溶液于标准板孔内，再加入显色剂200μL，混匀，25～30℃下显色15分钟，于酶标仪上在440nm波长下测定其吸光值，以吸光值为纵坐标，磷含量为横坐标绘制曲线。
表1：100μL标准品+200μL显色剂检测数据
备注：每个浓度点平行检测，取吸光度平均值；净吸光值为各浓度点检测值减去零点吸光值的检测值。
结果如表1所示。以净吸光值为纵坐标，磷标准品浓度为横坐标绘制曲线，曲线方程为y＝0.008x+0.002(R2＝0.997)，曲线线性好，符合方法要求的R2≥0.99。
1.1.2样品测定
(1)称取牛奶2.5g(精确至0.1mg)，于125mL三角瓶中，放入几粒玻璃球，加10mL硝酸，然后放在电热板上，在200～300摄氏度下加热。待剧烈反应结束后取下，稍冷却，再加入10mL高氯酸，重新放于电热板上，在200～300摄氏度下加热。在消化液剩下3mL～5mL时取下，冷却，转入100mL容量瓶中；
(2)向容量瓶中加入50mL水，加入0.10～0.15mL二硝基酚指示剂，用6mol/LNaOH调至黄色，用0.2mol/LHNO3调至无色，用0.1mol/LNaOH调至微黄色，定容至100mL作为待测液，每个样品设置两个平行试验。同时做空白试验，作为对照品；
(3)分别吸取100μL待测液及对照品置于标准板孔内，再加入显色剂200μL，25～30℃下显色15分钟，于酶标仪上在440nm波长下测定其吸光值，并计算磷含量(参与曲线计算的样品吸光值是通过实际测得的样品吸光值减去空白吸光值)。
计算公式：
P(mg/100g)＝(C×V)×100/(M×1000)
式中：
P---样品中磷含量，mg/100g；
C---从标准曲线中查得的待测液中磷的浓度，μg/mL；
V---待测液体积，mL，100；
M---样品的质量，g。
对比例1
在该对比例中，按照上述实施例1中的方法绘制标准曲线，其区别在于，标准品溶液加入量为50μL，显色剂加入量为150μL，具体检测值如下：
表2：50μL标准品+150μL显色剂检测数据
根据表2数据，以净吸光值为纵坐标，磷标准品浓度为横坐标绘制曲线，曲线方程为y＝0.004x+0.003(R2＝0.969)曲线线性不符合方法要求的R2≥0.99。从而说明当标准品溶液与显色剂的加入量为50μL和150μL时，标准曲线不准确，进而将影响待测液中磷含量的确定，导致检测结果的准确性偏低。
对比例2
在该对比例中，按照上述实施例1中的方法绘制标准曲线，其区别在于，标准品溶液加入量为200μL，显色剂加入量为100μL，具体检测值如下：
表3：200μL标准品+100μL显色剂检测数据
根据以上数据，以净吸光值为纵坐标，磷标准品浓度为横坐标绘制曲线，曲线方程为y＝0.011x+0.004(R2＝0.985)曲线线性不符合方法要求的R2≥0.99。从而说明当标准品溶液与显色剂的加入量为200μL和100μL时，标准曲线不准确，进而将影响待测液中磷含量的确定，导致检测结果的准确性偏低。
综上可知，标准品溶液与显色剂的加入量显著影响标准曲线的准确性，进而影响最终检测结果的准确性。当标准品溶液与显色剂的添加量分别为100μL和200μL时，标准曲线的准确性较高。进一步地，待测液与显色剂反应时，待测液的加入量同样为100μL时，能够准确地测定出样品中磷含量。
实施例2
分别按照国标GB5413.22-2010测定磷含量的方法及实施例1的方法测定儿童牛奶及调制乳中磷含量，具体检测数据如下：
表4：检测方法比较结果
根据以上数据，与实施例1检测数据与国标方法检测数据相对偏差可以满足GB5413.22-2010中的方法要求的允许差。从而表明本发明的方法能够准确地测定磷含量。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。