本发明涉及一种生物毒素的检测方法，尤其涉及一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，属于化学生物检测技术领域。
背景技术：
现有的生物毒素TTX检测方法主要有生物测定法、仪器分析法、传感器法和免疫测定法等，但没有一种方法是针对TTX产生菌进行检测的；目前市场上出现了TTX快速检测产品，如ELISA试剂盒、免疫层析试纸条，普遍存在检测灵敏度低、线性范围窄、易出现假阳性、价格高等问题。
技术实现要素：
本发明就是针对上述问题，提出一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，该检测方法更易防干扰，不易产生假阳性，可以实现产毒菌种的高通量快速筛选，为开发相应微生物源毒素产品助力。
为达到上述目的，本发明提出了一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，主要包含样品处理、菌落转印、抗原包被、封闭、洗涤加一抗、洗涤加二抗、斑点显色七个步骤，具体为：
步骤一、样品处理：主要为用无菌水清洗河豚鱼,无菌条件下取出河豚鱼卵巢,加无菌水研磨,取匀浆后的组织液进行10倍系列稀释涂板法分离,然后进行恒温培养；
步骤二、菌落转印：取与培养皿同等大小的NC膜用乙酸钠溶液(1N，Ph7.4)浸润,将长有菌落LB平板置于4℃，然后将无菌NC膜铺于长有菌落的平板上，并与菌落接触，直至NC膜完全浸湿，在3个或更多不对称位置上做好标记，用平口镊子将滤膜从琼脂面上揭下；26℃培养原平板，以便后期挑取产TTX阳性菌株；
步骤三、抗原包被：将NC膜的菌落面向下,倒置于一块新的空平皿盖子上,平皿内加入37％甲醛溶液，封口膜密封平皿，置振荡器上，1hr,37℃。
步骤四、封闭：将膜，用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，然后用牛血清封闭；
步骤五、洗涤，加一抗：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育；
步骤六、洗涤，加二抗：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育；
步骤七、斑点显色：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，用10ml，1mg/mL pNPP溶液10ml孵育，10min,直至斑点可见。若用于定量检测，可置酶联免疫分析仪系统根据斑点亮度计算TTX含量。
在本发明的步骤一中，恒温培养的温度为26℃。
在本发明的步骤三中，置振荡器设置时间为一小时，温度为37℃。
在本发明的步骤四中，用牛血清封闭的时间为一小时，温度为37℃。
在本发明的步骤五中，用膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育时间为一小时，温度为37℃。
在本发明的步骤六中，将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育时间为,温度为37℃。
采用上述方法后，本发明的具体优点如下：
1、和其他检测方法比如荧光PCR、蛋白质芯片、仪器分析技术比较，具有成本低、操作简便等优点；
2、与市场有售的ELISA检测试剂盒比较，原理虽然也是基于酶联免疫检测，但可以说是第二代升级版本，针对性强、灵敏度更高，经验证可高2-3数量级；采用间接法比现在市售产品的直接法竞争法更易防干扰，不易产生假阳性；
3、不依赖特定仪器，若定性检测，只需肉眼观测膜上斑点即可；
4、更可以实现产毒菌种的高通量快速筛选，为开发相应微生物源毒素产品助力。
具体实施方式
下面采用具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，主要包含样品处理、菌落转印、抗原包被、封闭、洗涤加一抗、洗涤加二抗、斑点显色七个步骤，具体为：
步骤一、样品处理：主要为用无菌水清洗河豚鱼,无菌条件下取出河豚鱼卵巢,加无菌水研磨,取匀浆后的组织液进行10倍系列稀释涂板法分离,然后进行恒温培养；
步骤二、菌落转印：取与培养皿同等大小的NC膜用乙酸钠溶液(1N，Ph7.4)浸润,将长有菌落LB平板置于4℃，然后将无菌NC膜铺于长有菌落的平板上，并与菌落接触，直至NC膜完全浸湿，在3个或更多不对称位置上做好标记，用平口镊子将滤膜从琼脂面上揭下；26℃培养原平板，以便后期挑取产TTX阳性菌株；
步骤三、抗原包被：将NC膜的菌落面向下,倒置于一块新的空平皿盖子上,平皿内加入37％甲醛溶液，封口膜密封平皿，置振荡器上，1hr,37℃。
步骤四、封闭：将膜，用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，然后用牛血清封闭；
步骤五、洗涤，加一抗：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育；
步骤六、洗涤，加二抗：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育；
步骤七、斑点显色：用PBS-T洗涤3次，每次3分钟，用10ml，1mg/mL pNPP溶液10ml孵育，10min,直至斑点可见。若用于定量检测，可置酶联免疫分析仪系统根据斑点亮度计算TTX含量。
在本发明的步骤一中，恒温培养的温度为26℃。
在本发明的步骤三中，置振荡器设置时间为一小时，温度为37℃。
在本发明的步骤四中，用牛血清封闭的时间为一小时，温度为37℃。
在本发明的步骤五中，用膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育时间为一小时，温度为37℃。
在本发明的步骤六中，将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育时间为,温度为37℃。
总的来说，本品采用高度特异性的抗体抗原反应及间接非竞争结合的原理，菌落中可能含有的生物毒素TTX首先通过与菌体蛋白偶联到NC膜上，通过生物毒素TTX单克隆抗体和酶标的抗抗体结合从而使底物显色，而在膜上呈现肉眼看见的斑点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。