受农药侵害烟叶的氨基酸总量测量方法与流程

本发明涉及化学分析检测领域，特别是指受农药侵害烟叶的氨基酸总量测量方法。

背景技术：

二氯喹啉酸是防除稻田稗草的特效选择性除草剂，属激素型喹啉羧酸类除草剂，杂草中毒症状与生长素类作用相似，主要用于防治稗草且适用期很长，1-7叶期均有效。水稻安全性好。

有关研究表明二氯喹啉酸作为激素类除草剂，能够刺激乙烯在植物体内积累。二氯喹啉酸的靶标位点位于细胞壁的生物合成中，在禾本科植物中起到细胞壁合成抑制剂的作用，不同禾本科植物作用位点对二氯喹啉酸的敏感性。乙烯可抑制细胞壁合成酶的活性从而减少细胞壁的合成，乙烯含量的提高引起了ABA的积累，ABA在调节植物生长、叶片衰老、气孔开放起重要的作用。

二氯喹啉酸在土壤中有积累作用，对烟草生产会产生明显的药害。我国部分烟田曾因氯喹啉酸出现大面积烟草畸形生长现象，症状为新叶先出现不正常生长,叶缘下卷，叶片向背皱缩,致使叶片狭长，严重者呈线状，严重影响烟草的产量和质量。

由于烟草这一作物的特殊性，对于其受到氯喹啉酸的影响将直接影响烟农的收成，以及烟叶的质量，因此，对于氯喹啉酸对烟草的影响，需要进行多方面的，准确的，可靠的分析，目前，对于农药侵害植物的分析虽然有报道以及一般性的分析方法，但针对氯喹啉酸对烟草侵害的研究分析还相对较少，造成在氯喹啉酸对烟草的侵害的程度，影响等少有深入的了解，并的分析的结果上还存在较大的准确度差异。

技术实现要素：

本发明提出一种农药侵害烟叶的氨基酸总量测量方法，解决了现有技术中氯喹啉酸对烟草侵害程度难以测定，或测定不够准确的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：受农药侵害烟叶的氨基酸总量测量方法，包括以下步骤：

(1)配制试剂，包括：pH5.0的柠檬酸缓冲液、1％水合茚三酮溶液、0.1％抗坏血酸溶液、标准谷氨酸钠溶液；

(2)氨基酸态氮的微克数为横坐标，以吸光密度值为纵坐标绘制标准曲线；

(3)剪取烟草第四片展开叶，清洗擦干，迅速称取0.3g，并将其剪成碎片，加入10mL蒸馏水，加热至沸，冷却后过滤备用；

(4)吸取上面的样品提取液1mL，加入1mL 1％水合茚三酮溶液，在80℃恒温水浴中加热15分钟，取出后用pH5.0的柠檬酸缓冲液稀释至10mL，在分光光度计610nm处测定吸光密度值，再从标准曲线上查出相应的氨基酸微克数；根据以下公式求出每克鲜样品的含氮量：

式中：

C――由标准曲线查出每毫升提取液中氨基态氮含量；

10——比色液体积；

L——测定时取样品液毫升数；

0.3——样品重量。

(5)在烟草5～6片真叶期移入二氯喹啉酸添加浓度为1.04×10^-3mg/kg、2.08×10^-3mg/kg、4.17×10^-3mg/kg、8.33×10^-3mg/kg、1.67×10^-2mg/kg药土中，分别在7d、14d、21d、28d、35d采用步骤(1)～(4)测量烟叶的氨基酸总量。

进一步，步骤(1)中，各试剂的配制，采用以下配比进行：

pH5.0的柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸4.31克及柠檬酸钠8.68克，溶于蒸馏水中稀释500mL。

1％水合茚三酮溶液：称取1克水合茚三酮，将其溶于100mL 95％的乙醇中。

0.1％抗坏血酸溶液：称取0.05克抗坏血酸，将其溶于蒸馏水中并稀释至50mL。

标准谷氨酸钠溶液：精确量取0.1883克食用味精在80℃下烘干，然后将烘干的食用味精溶于pH5.0的柠檬酸缓冲液中，并定容至50mL。取此溶液5mL用pH5.0柠檬酸缓冲液稀释至50mL，即为含氨基态氮每毫升25微克的标准液。

进一步，步骤(3)中，烟草碎片的长度≤1mm。

本发明的所述农药侵害烟叶的氨基酸总量测量方法，针对烟草的特性，结合对氯喹啉酸的侵害机理研究，对农药侵害过程氨基酸总量测定中，试剂的选配，操作环境、参数等进行了较为严格的调整与控制，使得到的氯喹啉酸侵害烟叶的氨基酸总量的测量更加准确，可靠，为合理使用氯喹啉酸以及消除影响，提供科学的依据。

附图说明

图1为氨基态氮标准曲线；

图2为二氯喹啉酸处理的不同时期，烟草氨基酸含量。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

烟草种子采用品种为K326。温室播种，育苗，于五至六片真叶期移栽，进行农药侵害烟叶的氨基酸总量测量

(1)试剂配制

pH5.0的柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸4.31克及柠檬酸钠8.68克，溶于蒸馏水中稀释500mL。

1％水合茚三酮溶液：称取1克水合茚三酮，将其溶于100mL 95％的乙醇中。

0.1％抗坏血酸溶液：称取0.05克抗坏血酸，将其溶于蒸馏水中并稀释至50mL。

标准谷氨酸钠溶液：精确量取0.1883克食用味精(含谷氨酸钠80％，而谷氨酸钠含氮8.3％)在80℃下烘干(大约2小时)，然后将烘干的食用味精溶于pH5.0的柠檬酸缓冲液中，并定容至50mL。取此溶液5mL用pH5.0柠檬酸缓冲液稀释至50mL，即为含氨基态氮每毫升25微克的标准液。

(2)标准曲线的制作

表1氨基酸标准曲线

取6支试管，按表1依次加入试剂，置于80℃恒温水浴上保温15分钟，取出冷却后用pH5.0的柠檬酸缓冲液稀释至10mL，立即按0、5、10、15、20、25微克的顺序在分光光度计610nm处测定吸光密度值。以氨基酸态氮的微克数为横坐标，以吸光密度值为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。

(3)氨基酸的提取

剪取烟草第四片展开叶，清洗擦干，迅速称取0.3g，并将其剪成碎片(≤1mm)，加入10mL蒸馏水，加热至沸，冷却后过滤备用。

(4)氨基酸总量的测定

吸取上面的样品提取液1mL，加入1mL 1％水合茚三酮溶液，在80℃恒温水浴中加热15分钟，取出后用pH5.0的柠檬酸缓冲液稀释至10mL，在分光光度计610nm处测定吸光密度值，再从标准曲线上查出相应的氨基酸微克数。根据以下公式求出每克鲜样品的含氮量。

式中C――由标准曲线查出每毫升提取液中氨基态氮含量(mg)；

10——比色液体积(mL)；

L——测定时取样品液毫升数；

0.3——样品重量(g)。

(5)在烟草5～6片真叶期移入二氯喹啉酸添加浓度为1.04×10^-3mg/kg、2.08×10-3mg/kg、4.17×10-3mg/kg、8.33×10-3mg/kg、1.67×10-2mg/kg药土中，分别在7d、14d、21d、28d、35d采用步骤(1)～(4)测量烟叶的氨基酸总量。

根据上述方法测定氯喹啉酸对烟草叶片氨基酸含量的影响，测定结果如图2所示，在二氯喹啉酸处理的不同时期，烟草氨基酸含量都有升高的趋势。在移植后7d，正常烟草和处理烟草氨基酸含量差异不显著。移植后14d，二氯喹啉酸处理烟草叶片氨基酸含量均高于对照，并且随着施药量的增加，烟草氨基酸含量有升高趋势。移植后21d，二氯喹啉酸浓度为1.04×10-3mg/kg、2.08×10-3mg/kg、4.17×10-3mg/kg、8.33×10-3mg/kg、1.67×10-2mg/kg处理的烟草叶片氨基酸含量分别较对照烟草提高28.98％、44.49％、64.15％、81.92％、129.19％。结果表明，烟草经二氯喹啉酸处理叶片中氨基酸含量有升高趋势。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。