一种用于检测潜在结核的特异性标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医学检验领域，具体涉及一种用于检测潜在结核的特异性标志物及其应用。

背景技术：

结核是一种由人结核分枝杆菌引起的疾病。根据WHO最新数据显示，全球约有30％的人口感染结核病菌，现有结核病人约2000万，每年新增800-1000万人，每年约有200万人死于结核病，是其它所有传染病总和。我国结核病情尤为严重，现有结核感染者5亿，占全球的20％，每年约13万人死于结核病，是其它所有传染病总和的2倍。如不及时采取措施，未来十年可能有3000万人患病，将会导致严重的公共卫生和社会问题。目前结核病控制的存在的主要问题是病人发现率低，治愈率低。在诊断方面，现有的检测方法不能很好的区分潜在结核和活动性结核，目前还没有一种潜在结核诊断的金标准。

结核菌素皮试(tuberculin skin test,TST)是一种广泛使用的结核检测方法，已经有100多年的历史，由于其操作简单、检测成本低，在全世界得到广泛使用。但是这种方法会把接种过卡介苗的非结核患者诊断为结核阳性，其结核检测错误率较高。γ-干扰素释放试验(interferon-γrelease assays，IGRAs)能够很好的克服这一缺点，对结核病检测的灵敏度和特异性都很高。这种方法利用ELISA检测全血中IFN-γ释放量或ELISPOT检测外周血单核细胞中释放IFN-γ的T淋巴细胞数量进行检测。IFN-γ释放实验采用RD-1区的特异性抗原ESAT-6，CFP-10和TB7.7(RD-11)，这些区域特异性的存在于人结核杆菌，而卡介苗菌株BCG和大多数环境结核杆菌没有这些区域。

不管是结核菌素皮试还是人干扰素-γ释放实验都不能很好的检出潜在结核患者，关键在于没有特异性和灵敏度高的潜在结核抗原。因此，加大结核病菌的基础研究，寻找快速，准确，实用的潜在结核检测方法，提高潜在结核病人的检出率，是目前结核病诊断需要迫切解决的问题。

技术实现要素：

为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种用于检测潜在结核的特异性标志物及其应用。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

一种用于检测潜在结核的特异性标志物，其为抗原Rv2626c、抗原Rv3716c、抗原TrxC、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的组合、抗原Rv2626c和抗原TrxC的组合、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的组合。

优选地，所述抗原Rv2626c是如序列表中sequence ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或是将序列表中的sequence ID No.1的氨基酸残基经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与sequence ID No.1所示具有相同功能的衍生的蛋白质。

优选地，所述抗原Rv3716c是如序列表中sequence ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或是将序列表中的sequence ID No.2的氨基酸残基经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与sequence ID No.2所示具有相同功能的衍生的蛋白质。

优选地，所述抗原TrxC是如序列表中sequence ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或是将序列表中的sequence ID No.3的氨基酸残基经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与sequence ID No.3所示具有相同功能的衍生的蛋白质。

一种所述的特异性标志物在制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜在结核用途的产品中的应用。

优选地，所述具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜在结核用途的产品中包括如下内容的说明书：人的外周全血样本经过所述特异性标志物刺激后，以释放出的IFN-γ或者IFN-γ与TNF-α的比值作为潜在结核诊断因子。

优选地，所述具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜在结核用途的产品中包括如下内容的说明书：当所述特异性标志物是Rv2626c、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的组合、或抗原Rv2626c和抗原TrxC的组合时，人的外周全血样本经过所述特异性标志物刺激后，以释放出的IFN-γ作为潜在结核诊断因子；当所述特异性标志物是抗原Rv3716c、抗原TrxC、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的组合时，人的外周全血样本经过所述特异性标志物刺激后，以释放出的IFN-γ与TNF-α的比值作为潜在结核诊断因子。

一种用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜在结核的试剂盒，包含所述的特异性标志物。

优选地，所述试剂盒中还包括配合所述特异性标志物一起使用的试剂。

一种所述的试剂盒在制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜在结核用途的产品中的应用。

本发明与现有技术对比的有益效果包括：本发明经过大量研究，筛选出了Rv2626c、Rv3716c、TrxC抗原或其两两组合作为潜在结核检测的特异性标志物，能够判断受试者是否为潜在结核患者，并可以将潜在结核患者与结核病人区分开，其在潜在结核诊断试剂盒，在潜在结核鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查中具有较大的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中所制备的Rv2626c蛋白表达SDS-PAGE电泳图。泳道1为PET-32a空载体转染大肠杆菌诱导表达后菌液上清；泳道2为PET-32a-Rv2626c转染大肠杆菌诱导表达后菌液上清；泳道3为蛋白分子标记；

图2为本发明实施例1中所制备的Rv3716c蛋白表达SDS-PAGE电泳图。泳道1为PET-32a空载体转染大肠杆菌诱导表达后菌液上清；泳道2为PET-32a-Rv3716c转染大肠杆菌诱导表达后菌液上清；泳道3为蛋白分子标记；

图3为本发明实施例1中所制备的TrxC蛋白表达SDS-PAGE电泳图。泳道1为PET-32a-TrxC转染大肠杆菌诱导表达后菌液上清；泳道2为PET-32a空载体转染大肠杆菌诱导表达后菌液上清；泳道3为蛋白分子标记；

图4为本发明实施例1中的IFN-γ对3个潜在结核特异性抗原的反应；

图5为本发明实施例1中的TNF-α对3个潜在结核特异性抗原的反应。

具体实施方式

下面结合附图通过具体实施例对本发明进行详细的介绍，以使更好的理解本发明，但下述实施例并不限制本发明范围。

本发明提供一种用于检测潜在结核的特异性标志物，在具体的实施方式中，其为抗原Rv2626c、抗原Rv3716c、抗原TrxC、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的组合、抗原Rv2626c和抗原TrxC的组合、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的组合。

本发明所称的“潜在结核”为感染了结核杆菌，即体内携带有结核杆菌，但体内的结核杆菌处于休眠期，还没有爆发出来引起人体一些临床上可见的结核症状。

以下通过一个优选的实施例对本发明作详细阐述，下述实施例中：所使用的实验方法、检测方法或分析方法等如无特别说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等如无特别说明，均可以从市购获得，所述的“常温”是指25-37℃；抗原Rv2626c、抗原Rv3716c或抗原TrxC在下文中也称“潜在结核特异性抗原”。

在一些优选的实施例中，可以优选以下方案中的至少一个：

所述抗原Rv2626c是如序列表中sequence ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或是将序列表中的sequence ID No.1的氨基酸残基经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与sequence ID No.1所示具有相同功能的衍生的蛋白质。

所述抗原Rv3716c是如序列表中sequence ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或是将序列表中的sequence ID No.2的氨基酸残基经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与sequence ID No.2所示具有相同功能的衍生的蛋白质。

所述抗原TrxC是如序列表中sequence ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或是将序列表中的sequence ID No.3的氨基酸残基经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与sequence ID No.3所示具有相同功能的衍生的蛋白质。

本发明还提供一种所述的特异性标志物在制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜在结核用途的产品中的应用。

在一些优选的实施例中，所述具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜在结核用途的产品中包括如下内容的说明书：人的外周全血样本经过所述特异性标志物刺激后，以释放出的IFN-γ或者IFN-γ与TNF-α的比值作为潜在结核诊断因子。

在另一些优选的实施例中，所述具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜在结核用途的产品中包括如下内容的说明书：当所述特异性标志物是Rv2626c、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的组合、或抗原Rv2626c和抗原TrxC的组合时，人的外周全血样本经过所述特异性标志物刺激后，以释放出的IFN-γ作为潜在结核诊断因子；当所述特异性标志物是抗原Rv3716c、抗原TrxC、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的组合时，人的外周全血样本经过所述特异性标志物刺激后，以释放出的IFN-γ与TNF-α的比值作为潜在结核诊断因子。

本发明还提供一种用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜在结核的试剂盒，包含所述的特异性标志物。

在一些优选的实施例中，所述试剂盒中还包括配合所述特异性标志物一起使用的试剂。

本发明还提供一种所述的试剂盒在制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查潜在结核用途的产品中的应用。

以下通过更具体的实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1

1.分子克隆潜在结核特异性抗原

1.1提取结核分枝杆菌H37Rv菌株(北京株)总RNA

1)用接种环取结核分枝杆菌H37Rv菌株(北京株)于7H11固体培养基中，37℃培养5-6周，用接种环挑取单个菌落于体积比为0.1％的7H9吐温液体培养基中，2周后转种，待OD₆₀值达到0.5-0.8时备用。

2)离心去除培养基上清，用PBS洗一遍，制备成1×10⁹CFU/份，加入新配置的甲醇氯仿混悬液(甲醇和氯仿的体积比为1:3)1ml，涡旋震荡1分钟，立刻加入Trizol5ml，涡旋震荡15秒。

3)于冰上静置10分钟，12000g离心10分钟，取上层水相，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃静止2小时。

4)10000g离心10分钟后弃上清，用70％乙醇洗两次，自然干燥后加入DEPC水溶解，得到H37Rv菌株总RNA。

1.2 RT-PCR获取目的基因片段

1.2.1引物设计

根据H37Rv菌株基因组DNA序列(NCBI Reference SEQ:NC_000962.3)设计引物，分别进行RT-PCR获得Rv2626c，Rv3716c和TrxC的全长CDS序列，扩增引物如下：

Rv2626c上游引物P1(如sequence ID No.4所示)：ATGACCACCGCACGCG

Rv2626c下游引物P2(如sequence ID No.5所示)：CTAGCTGGCGAGGGCCAT

Rv3716c上游引物P3(如sequence ID No.6所示)：ATGCAACCCGGAGGCGAC

Rv3716c下游引物P4(如sequence ID No.7所示)：TCAGATCCCTGGTACAGGT

TrxC上游引物P5(如sequence ID No.8所示)：ATGACCGATTCCGAGAAG

TrxC上游引物P6(如sequence ID No.9所示)：CTAGTTGAGGTTGGGAAC

再次设计引物分别加入酶切位点BamHI和EcoRI，酶切后连接在载体PET-32a中，构建成表达载体PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC。

带酶切位点的引物如下：

Rv2626c上游引物P7(如sequence ID No.10所示)：

CGGATCCATGACCACCGCACGCG

Rv2626c下游引物P8(如sequence ID No.11所示)：

GGAATTCCTAGCTGGCGAGGGCCAT

Rv3716c上游引物P9(如sequence ID No.12所示)：

CGGATCCATGCAACCCGGAGGCGAC

Rv3716c下游引物P10(如sequence ID No.13所示)：

GGAATTCTCAGATCCCTGGTACAGGT

TrxC上游引物P11(如sequence ID No.14所示)：

CGGATCCATGACCGATTCCGAGAAG

TrxC上游引物P12(如sequence ID No.15所示)：

GGAATTCCTAGTTGAGGTTGGGAAC

1.2.2逆转录反应

在0.2ml EP管中，取如上1.1中提取的H37Rv菌株总RNA 1μg，按如下比例建立逆转录反应体系：

于PCR仪上50℃反应30min，然后94℃下2min灭活逆转录酶，合成cDNA于1.2.3中的PCR反应。

1.2.3 Rv2626c，Rv3716c和TrxC的基因片段扩增

在0.2ml EP管中，取如上1.2.2中H37Rv菌株的cDNA，按如下比例建立基因片段扩增反应体系：

于PCR仪上94℃5min，然后30个PCR循环，每个循环94℃45s，60℃45s，72℃1min，最后延伸72℃5min。

1.3表达载体构建

将PCR扩增的Rv2626c，Rv3716c和TrxC的基因片段进行1％琼脂糖电泳，在紫外灯下用手术刀片切下相应大小的DNA片段，称重后移入EP管。根据DNA片段纯化试剂盒说明书进行回收。

1.3.1将纯化的PCR片段连接到PMD-18T载体上

反应体系如下：

1.3.2重组质粒的转化

1)取一管DH5α感受态细胞于冰上融化后加入上述连接产物，轻轻混匀。

2)冰上静置20min。

3)将EP管在42℃下热激60s。

4)快速取出EP管在冰上放置1-2min。

5)加入800μL不含抗性的LB液体培养基，转移至摇床，37℃摇震荡培养1h。

6)取出EP管，在常温下4000rpm，离心1min，吸取700μL上清，剩余200μL轻轻吹打重悬细胞。

7)将重悬细胞均匀涂布于含有氨苄抗性(100mg/ml)的LB固体培养基中，37℃下培养12-16h。

1.3.3提取质粒并测序

从含有氨苄抗性(100mg/ml)的LB固体培养基中挑取10个菌落进行克隆PCR进行阳性鉴定，并接种于一块新的含抗性的LB固体培养基中。对克隆PCR鉴定为阳性的菌落进行扩大培养，提取质粒并测序。质粒提取过程按质粒提取试剂盒说明书操作。

1.3.4酶切与纯化

将测序正确的PMD-18T-Rv2626c，PMD-18T-Rv3716c和PMD-18T-TrxC，以及表达载体PET-32a进行BamHI和EcoRI双酶切。酶切产物进行1％琼脂糖电泳，目的片段切胶回收，并用胶纯化试剂盒纯化。

1.3.5连接与转化

将纯化的带酶切位点的Rv2626c，Rv3716c和TrxC基因片段和载体PET-32a分别进行如下连接反应：

将经上述连接反应得到的重组的PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC表达载体分别转化大肠杆菌Rosetta-gami 2(DE3)，并在含有氨苄(50mg/ml)LB固体培养基中筛选阳性克隆。

1.4表达

利用大肠杆菌体外诱导表达潜在结核特异性抗原的具体过程为：

1)挑取鉴定为阳性的菌斑于3ml含有氨苄抗性(50mg/ml)的LB液体培养中，37℃震荡培养12-16小时。

2)按1％转种于新鲜配置的含有氨苄抗性(50mg/ml)的LB液体培养中，37℃震荡培养至OD₆₀₀值为0.4-0.6。

3)加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃下诱导培养3-16小时。

4)4℃10000g下离心5min，分别收集上清和沉淀。

1.5纯化

所有在大肠杆菌表达的蛋白均带有组氨酸标签，可以通过Ni-NAT进行亲和纯化，具体过程如下：

1)加入150μL细胞裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油)和蛋白酶抑制剂PMSF。

2)冰上超声破碎细胞。

3)加入10％triton X-100，使终浓度为0.05％，充分混匀，冰上放置10分钟。

4)4℃13000g离心15min，取上清。

5)将Ni-NAT用10倍柱体积的细胞裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油)平衡。

6)将上清蛋白样品加入到Ni-NAT柱中，流速为15ml/h。

7)用5倍柱体积的细胞裂解缓冲液冲洗Ni-NAT一次，流速为30ml/h。

8)用5倍柱体积的内毒素缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.9，0.5％ASB-14)冲洗Ni-NAT一次，流速为30ml/h。

9)用5倍柱体积的洗脱液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油，250mM咪唑)冲洗Ni-NAT一次，流速为15ml/h，收集洗脱液。

10)12.5％SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。

1.6结果

如图1、2和3所示，与对照PET-32a空载体转染大肠杆菌Rosetta-gami 2(DE3)相比，PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC转染大肠杆菌Rosetta-gami 2(DE3)后在0.5M IPTG诱导下有特异性的蛋白条带出现。通过与蛋白分子标记对比，Rv2626c，Rv3716c和TrxC分子大小为12KDa、10KDa和10KDa。

2.评估潜在结核患者和结核病人对潜在结核特异性抗原的反应

2.1实验样本

实验样本如表1所示：

表1受试者样本特征情况表

结核病人样本：40例结核病人外周全血实验样本采集自深圳市第三人民医院结核科门诊或住院的结核病人，经结核杆菌培养所有受试者干扰素释放实验均为阳性。

根据潜在结核的定义选取的潜在结核患者样本为：35例潜在结核患者来自于其家庭成员至少有一个是结核病阳性，且在一起共同生活超过半年以上，且排除结核杆菌培养为阳性的患者。

2.2γ-干扰素释放试验

γ-干扰素释放试验采用QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)试剂盒(Cellestis，Qiagen GmBH)，所有实验步骤按厂家说明书进行操作。本实验35名潜在结核患者和40名结核病人γ-干扰素释放试验均为阳性，说明γ-干扰素释放试验不能很好区分潜在结核和活动性结核。

2.3潜在结核特异性抗原检测

2.3.1外周全血分析

1)将肝素钠静脉全血用RPMI1640稀释10倍。

2)往48孔平底细胞培养板中加入稀释外周全血，每孔400μL，每个样本4个重复。

3)每孔添加4μL青霉素(10000U/ml)和4μL链霉素(10mg/ml)。

4)每个样本分别添加Rv2626c，Rv3716c和TrxC潜在结核特异性抗原，终浓度为5ug/ml；同时设置一个空白对照，该孔不添加任何潜在特异性抗原。

5)37℃、5％二氧化碳培养箱培养6天。

6)离心收集血清。

2.3.2 IFN-γ和TNF-α检测

IFN-γ和TNF-α检测采用达科为生物工程有限公司人IFN-γELISA Kit和人TNF-αELISA Kit。操作过程按说明书进行。

2.4实验结果与判读

应用潜在结核特异性抗原Rv2626c，Rv3716c和TrxC对40名结核病人和35名潜在结核患者外周全血进行特异性刺激，然后应用ELISA检测血清样本中的IFN-γ和TNF-α的含量，我们发现潜在结核患者血清中IFN-γ的含量明显高于结核病人，与之相反，潜在结核患者血清中TNF-α的含量明显低于结核病人，结果如图4和图5所示，表明经潜在结核特异性抗原刺激，IFN-γ可以作为潜在结核患者特异性检测因子，TNF-α可以作为结核病人特异性检测因子。我们把受试的35名潜在结核患者设为诊断组，另外40名结核病人作为对照组，以诊断组阳性率最高和对照组阳性率最低为标准，利用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC curve)筛选出最佳阳性判断阈值(如表2所示)。受试者血清中IFN-γ和TNF-α含量高于阳性判断阈值的判定为阳性，低于阳性判断阈值的判断为阴性。

IFN-γELISA检测中，如表2所示，Rv2626c，Rv3716c和TrxC对潜在结核患者阳性判定数均为31个，阳性率为31/35＝88.5％；Rv2626c，Rv3716c和TrxC对结核病人阳性率分别为7.5％，12.5％和10％。由此可以看出，三者相比，Rv2626c对潜在结核患者检测的准确率最高。

TNF-αELISA检测中，如表2所示，Rv2626c，Rv3716c和TrxC对潜在结核患者阳性判定数均为4个，阳性率为4/35＝11.4％；Rv2626c，Rv3716c和TrxC对结核病人阳性率分别为70％，72.5％和57.5％。由此可以看出，Rv2626c和Rv3716c对结核病人的检测准确率要好于TrxC。

表2：IFN-γ和TNF-α对潜在结核特异性抗原的反应结果

于此同时我们发现，Rv2626c分别联合其它两种特异性抗原Rv3716c和TrxC能明显提高潜在结核患者阳性检测率，检测数据如表3所示。对于联合抗原检测来说，阳性判断标准为只要有一种抗原检测结果为阳性即判定为阳性。从表3中可以看出，Rv2626c+Rv3716c在潜在结核患者中的阳性率从88.5％提高到100％，在结核病人中的阳性率从7.5％提高到17.5％；Rv2626c+TrxC在潜在结核患者中的阳性率从88.5％提高到97.14％，在结核病人中的阳性率从7.5％提高到12.5％。

表3 IFN-γ对联合抗原的反应结果

基于IFN-γ可以作为潜在结核患者特异性检测因子，TNF-α可以作为结核病人特异性检测因子，猜想，利用IFN-γ/TNF-α比值作为潜在结核诊断因子可能有助于提高检测特异性和灵敏度。IFN-γ/TNF-α比值为同一病人血清样本经潜在结核特异性抗原刺激后IFN-γ释放量除以TNF-α释放量，并利用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC curve)筛选出最佳阳性判断阈值(如表4所示)，Rv2626c，Rv3716c和TrxC在潜在结核患者中的阳性率均为94.2％，在结核病人中的阳性率分别为7.5％，5％和5％。因此利用IFN-γ/TNF-α比值检测中，Rv3716c和TrxC具有最佳检测效果，对潜在结核患者检测的灵敏度为94.2％，特异性为95％。

表4 IFN-γ/TNF-α比值对潜在结核检测诊断效果

2.5结论

从本实验可以看出，利用潜在结核特异性抗原Rv2626c，Rv3716c和TrxC能够很好的区分潜在结核患者和结核病人。运用Rv2626c+Rv3716c或Rv2626c+TrxC双抗原进行IFN-γ单因子ELISA检测，可以提高潜在结核诊断的灵敏度，但代价是降低了检测的特异性。而运用Rv3716c和TrxC其中任何一个单抗原进行IFN-γ/TNF-α比值的双因子检测，潜在结核诊断灵敏度从88.5％提高到94.2％，特异性从92.5％提高到95％，没有因灵敏度提高而降低特异性。

目前，还没有一款产品能够很好的区分潜在结核和活动性结核，以γ-干扰素释放试验(interferon-γrelease assays，IGRAs)为例，它能同时检测出潜在结核和活动性结核，但是不能将两者区分开。本实验35名潜在结核患者和40名结核病人运用QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)试剂盒进行检测均呈阳性。而采用潜在结核特异性抗原Rv2626c，Rv3716c和TrxC，并运用我们开发的IFN-γ和TNF-α双因子检测能很好的区分潜在结核和活动性结核。

实施例2

潜在结核ELISA诊断试剂盒的制备。

1、待测样本准备

待测样本分为三组，分别为健康人，潜在结核患者和结核病人。

健康人样本数为18个，血液样本来自深圳市第三人民医院门诊部和住院部，经结核杆菌培养为阴性，且都有卡介苗接种经历。

潜在结核患者样本数为21个，血液样本来自于上述实施例1所述，且都有卡介苗接种经历。

结核病人样本数为29个，血液样本来自于上述实施例1所述，且都有卡介苗接种经历。

2、诊断过程涉及的试剂

诊断过程涉及的试剂包括ELISA板，IFN-γ包被抗体和检测抗体，TNF-α包被抗体和检测抗体，包被抗体缓冲液，检测抗体稀释液，洗涤缓冲液，终止缓冲液，TMB，Streptavidin-HRP，RPMI1640，青霉素，链霉素，Rv3716c和TrxC。结核诊断特异性抗原ESAT-6，CFP-10和TB7.7来自于QFT-GIT试剂盒。

3、潜在结核ELISA诊断试剂盒制备过程

1)用0.15M pH7.2的PBS作为包被抗体缓冲液稀释IFN-γ包被抗体和TNF-α包被抗体，具体稀释度依据不同抗体公司原料，生产批号和棋盘滴定实验而定。

2)往96孔ELISA板中加入含有包被抗体的工作液，每孔100μL。每五孔为一个检测单元，前四孔加入IFN-γ包被抗体工作液，第五孔加入TNF-α包被抗体工作液。

3)4℃过夜。

4)倒掉包被抗体工作液，用洗涤缓冲液洗涤5遍。

5)自然风干。

4、潜在结核ELISA诊断试剂盒操作过程

4.1全血样本制备

1)将肝素钠静脉全血用RPMI1640稀释10倍。

2)往48孔平底细胞培养板中加入稀释外周全血，每孔400μL，每个样本4个重复。

3)每孔添加4μL青霉素(10000U/ml)和4μL链霉素(10mg/ml)，得到全血样本。

4.2 IFN-γ和TNF-αELISA分析

ELISA分析参照达科为生物工程有限公司IFN-γ和TNF-α检测试剂盒说明进行，具体加样过程和顺序如表5所示：

表5：IFN-γ和TNF-αELISA分析的加样顺序表

5、阳性判定方法

ESAT-6和CFP-10刺激阳性判定阈值为IFN-γ25pg/ml，Rv3716c刺激后阳性判定阈值为IFN-γ/TNF-α2.07，TrxC刺激后阳性判定阈值为IFN-γ/TNF-α1.93。具体阳性判定标准如表6所示。

表6：阳性判定表

6、应用制备的ELISA试剂盒进行潜在结核诊断的实验结果

对18个健康人，21个潜在结核患者和29个结核病人应用达科为公司制备的潜在结核ELISA检测试剂盒进行检测，结果如表7所示。由于Rv3716C和TrxC刺激得到的实验结果相似，故表7只列出了Rv3716C刺激后得到的检测结果。从表7中可以看到，孔1(阴性对照)全部为阴性，孔2(阳性对照)全部为阳性，说明试剂盒制备没有问题，达到质量控制要求。

表7：采用Rv3716C抗原的潜在结核ELISA诊断试剂盒检测结果

本实施例仅详细介绍了使用潜在结核特异性抗原Rv3716c或TrxC来制备潜在结核诊断试剂盒，但其保护范围不限于使用潜在结核特异性抗原Rv3716C或TrxC，还包括使用潜在结核特异性抗原Rv2626c。此外，本实施例仅详细介绍了使用潜在结核特异性抗原联合活动性结核检测抗原SAT-6，CFP-10和TB7.7，但其保护范围不限于联合SAT-6，CFP-10和TB7.7，还包括联合其他活动性结核检测特异性抗原。另外，潜在结核诊断试剂盒还可以结合ELISA/ELISPOT/流式方法，制备相应的潜在结核ELISA诊断试剂盒、潜在结核ELILSPOT诊断试剂盒和潜在结核流式诊断试剂盒，本实施例仅详细介绍了潜在结核ELISA诊断试剂盒的制备，但其保护范围不限于使用其它通用技术使用本抗原，还包括结核ELILSPOT诊断试剂盒和结核流式诊断试剂盒及其他通用技术使用本抗原的试剂盒。

本发明的实施例2详细介绍了使用潜在结核特异性抗原并联合活动性结核检测抗原在制备潜在结核诊断试剂盒方面的应用，联合后的效果是通过一个产品就能同时区分健康人、潜在结核患者和活动性结核患者。在其他实施例中，还可以提供一种只检测潜在结核的试剂盒，与实施例2的区别仅在于只使用本发明筛选出的潜在结核特异性抗原，不联合其他活动性结核检测抗原，其他制备步骤和使用方法均相同，从而开发出一种只检测潜在结核的试剂盒。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。